Arbeitskreis
Biologische Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten

Abstracts der Tagung 2001

In 19 Kurzvorträgen wurden Themen aus verschiedenen Bereichen der Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten mit Mikroorganismen behandelt. Weiterhin wurde ein Poster zur Anwendung von Pflanzenextrakten gegen samenbürtige Krankheiten vorgestellt. Die Beiträge reichten von der Grundlagenforschung bis hin zu Feldversuchen. Auffallend war der im Vergleich zu den letzten Treffen gestiegene Anteil von Beiträgen, die sich mit Fragen der Fermentierung und Formulierung von Mikroorganismen beschäftigten. Am Abend hatten wir eine Führung durch die historische Einbecker Innenstadt.

Die Tagung war fand in einer netten, familiären Atmosphäre statt. Für die Organisation möchten ich Herrn Dr. Tilcher von der KWS recht herzlich danken.

Das nächste Treffen soll im Frühjahr 2003 in Raisdorf bei Kiel stattfinden.

E. Koch, Darmstadt

Titel der Abstracts:

• Pilzzellwandabbauende Enzyme in Nährlösung geschlossener Bewässerungssysteme
• Biologische Bekämpfung von Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in Tomaten durch bakterielle Antagonisten
• Optimierung biologischer Bekämpfung von Meloidogyne incognita und Fusarium oxy­sporum an Tomate durch Bodenbakterien
• Bekämpfung von Meloidogyne incognita mit dem apathogenen Fusarium oxysporum Fo162
• Biodiversität kartoffelassoziierter Bakterien und ihr antagonistisches Potenzial gegen Meloidogyne incognita
• Endophyten der Kartoffel und ihr antagonistisches Potential gegen die pflanzenpathogenen Pilze Verticillium dahliae und Rhizoctonia solani
• Charakterisierung der Rhizosphärenbakterien Stenotrophomonas maltophilia und S. rhizophilia
• Charakterisierung des chitinolytischen Systems des Biological Control Agents Serratia plymuthica strain HRO-C48
• Einfluß der Motilität, Adhäsion und der Bildung von Siderophoren und Antibiotika von Ps. fluorescens B5 und Ps. corrugata R117 auf die Rhizosphärenbesiedlung und die antagonistische Wirkung im Microcosmen-Versuch
• Der pflanzenwachstumsfördernder Wurzelendophyt Piriformospora indica: Vergleich mit arbuskulären Mykorrhizapilzen
• Wirkung von Waidextrakten auf samenbürtige Pilze
• Entwicklung eines Gewächshaus-Screeningverfahrens auf Aktivität gegen Tilletia caries
• Screening von Mikroorganismen und Pflanzenextrakte auf Aktivität gegen Phytophthora infestans
• Biologische Bekämpfung von Leptosphaeria maculans, dem Erreger der Wurzelhals- und Stängelfäule an Winterraps
• Optimierung von Prozessparametern zur Produktion von Mikroorganismen für den Pflanzenschutz
• Entwicklung einer Formulierung für Biological Control Agents
• Der nematophage Pilz Hirsutella rhossiliensis: Fermentation im 5-Liter Rührreaktor und Formulierung in Kapseln und Zuckerrübenpillen
• Integration antagonistischer Bakterien in den Pillierungsprozess von Zuckerrüben-Saatgut - Ergebnisse und Probleme

Pilzzellwandabbauende Enzyme in Nährlösung geschlossener Bewässerungssysteme

Das Auftreten von Suppressivität in geschlossenen Bewässerungssystemen wurde in den letzten Jahren mehrfach berichtet. Bisher wurden die zu Grunde liegenden Mechanismen diskutiert, aber nicht erforscht. Enzyme, die Bestandteile pilzlicher Zellwände abzubauen vermögen - wie zum Beispiel Chitinasen, Glucanasen, Cellulasen und Proteasen - könnten ein Faktor der natürlichen Unterdrückung von Pathogenen sein. Im Herbst 2000 und Frühjahr 2001 wurde in der Nährlösung von Tomatenkulturen in geschlossenen, hydroponischen Systemen (NFT) das natürliche Auftreten der genannten Enzyme beobachtet. Proteasen konnten während der gesamten Versuchsperiode nachgewiesen werden. Nach etwa drei Wochen wurde in beiden Vegetationsperioden eine Protease-Aktivität von etwa 0.1 mU erreicht und bis zur Beendigung der Versuche nach 6 bzw. 7 Wochen gehalten. Die höchste Protease-Aktivität konnte in der obersten Filterschicht der systemintegrierten Langsamfilter gefunden werden. Chitinasen konnten in der Frühjahrs-Kultur fast durchgehend nachgewiesen werden, jedoch nicht im Herbst 2000. Cellulasen und b-1,3-Glucanasen wurden nur gelegentlich detektiert. Die Resultate belegen, dass zellwandabbauende Enzyme in der Nährlösung geschlossener Bewässerungssysteme potentiell vorhanden sind. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Dynamik zellwandabbauender Enzyme und deren Bedeutung für die Pflanzenproduktion zu erforschen.

Biologische Bekämpfung von Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in Tomaten durch bakterielle Antagonisten

Aus verschiedenen Herkünften Vietnams wurden verschiedene Mikroorganismen isoliert und im in vitro-Screening zusammen mit weiteren 54 Isolaten auf ihre antagonistische Wirksamkeit gegen verschiedene Fusarium spp. in Dualkultur untersucht. Im Plattentest wiesen die Kulturfiltrate von Bacillus subtilis R51 nach Wachstum im M3-Medium die beste Hemmwirkung (90%) gegenüber F. oxysporum f. sp. lycopersici auf. Im Flüssigkulturtest wurde die vollständige Hemmung des Pathogens mit Kulturfiltraten von Paenibacillus polymyxa DA2 nach Kultur im EM und TSB erzielt. Zur Überprüfung der ad planta Aktivität wurden vier Antagonisten für die Biokontroll­versuche im Gewächshaus mit der Tomatensorte ,Harzfeuer' ausgewählt. Durch die Tauch- und Gießbehandlung des Wurzelbereichs der Tomatensämlinge mit den Bakterien­suspensionen wurde die Fusarium-Welke um 37,3% - 87,3% reduziert. Als weiterer Effekt wurde eine allgemeine Wachstumssteigerung der Tomatenpflanzen unter nicht infizierten Bedingungen sowie unter infizierten Bedingungen nachgewiesen. Die Pflanzenlängen der nicht infizierten Varianten erhöhte sich um 10,7%-11,4%, das Frisch- und Trockengewicht stieg um 11,2%-13,2% bzw. 10,8%-13,5% an. Signifikante Zunahmen konnten jedoch nur bei der Anwendung des Aktinomyceten MC1 festgestellt werden. Neben der Sichtbonitur wurde auch eine Befallsquantifizierung mittels ELISA durchgeführt. Die Proteinmenge (FPÄ) der behandelten Variante war um 79,55%-84,28% gegenüber der infizierten Kontrolle verringert und bestätigte die Ergebnisse zur Reduktion der Fusarium-Welke der klassischen Sichtbonitur.

Optimierung biologischer Bekämpfung von Meloidogyne incognita und Fusarium oxy­sporum an Tomate durch Bodenbakterien

Wurzelgallen-Nematoden der Gattung Meloidogyne und der Welkeerreger Fusarium oxy­sporum f. sp. lycopersici verursachen allein oder in Kombination weltweit schwere wirtschaft­liche Schäden in der Tomatenproduktion. Bislang wurden diese Krankheiten durch Boden­begasung mit Methylbromid bekämpft. Aufgrund der Toxizität und der Auswirkungen auf at­mosphärisches Ozon ist dieses Mittel ab dem Jahr 2001 weltweit verboten. In unserem Projekt wird untersucht, wie eine gesteigerte Wirksamkeit effektiver Rhizosphärebakterien zur biolo­gischen Bekämpfung beider Krankheitserreger an Tomaten genutzt werden kann. Zunächst wurden in Gewächshausversuchen Isolate selektiert, die in der Lage sind, den Befall durch Meloidogyne incognita oder Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici zu reduzieren. Drei der getesteten Bakterienstämme waren in der Lage, Symptome der Fusarienwelke signifikant zu verringern. Sieben getestete Stämme reduzierten Eiermassen- und Gallenzahlen von M. incognita. Die Wirkungsweise dieser Rhizosphärebakterien wird derzeit untersucht. Alle drei gegen F. oxysporum wirksamen Stämme induzieren auf pflanzlicher Seite Resistenz gegen F. oxysporum. Unterschiede in der Phenol- und Chlorophyllakkumulation wurden fest­gestellt. Die Untersuchungen zur Wirkungsweise der Bakterien gegen M. incognita sind noch nicht abgeschlossen.

Bekämpfung von Meloidogyne incognita mit dem apathogenen Fusarium oxysporum Fo162

Apathogene Fusarium oxysporum-Isolate werden zur biologischen Bekämpfung der Fusarium-Welke eingesetzt. Darüber hinaus zeigen einige Isolate eine gute Bekämpfung pflanzenparasitärer Nematoden, wie Meloidogyne spp., Pratylenchus goodeyi und Radopholus similis. Am Beispiel des Isolates F. oxysporum Fo162 wurde die Wirkungsweise des Antagonisten sowie dessen Wechselwirkungen mit Mykorrhizapilzen untersucht. Fo162 wurde mit 0,1 % (w/w) als Körnerbrutpulver in den Boden eingemischt. Nach 8 Wochen zeigte sich eine ca. 50 %ige Reduzierung der Anzahl Gallen und Eiermassen von M. incognita gegenüber den Kontrollpflanzen. Die Wirkungsweise von Fo162 war auf eine reduzierte Larveneindringung und verzögerten Entwicklung der Nematoden im Pflanzengewebe zurückzuführen. In vitro Untersuchungen der pilzlichen Kulturfiltrate zeigten eine 50 %ige Abtötung der Larven innerhalb von 9 Stunden Einwirkungszeit. Fo162 in Kombination mit Mykorrhiza führte zu einer signifikant erhöhten Mykorrhizierung von Tomaten, die aber nicht in einem besseren Bekämpfungserfolg von M. incognita resultierte. Die Anzahl Nematoden pro Galle war in den mykorrhizierten Pflanzen deutlich erhöht. Für Ertragsversuche an Cocktail-Tomaten wurde Fo162 auf kalzinierte Kieselgur aufgesprüht und in der Wirbelschichtanlage bei 25-30 °C getrocknet. Die Keimzahl nach Herstellung betrug 1,35 x 10⁸ cfu/g und sank nach 6 Monaten Lagerung bei 8 °C auf 1,33 x 10⁷ cfu/g. Fo162 wurde mit 10⁷ cfu/100 ml in das Pflanzsubstrat eingemischt. Mit Fo162 behandelte Cocktail-Tomaten hatten einen 16 % höheren Ertrag als die Kontrolle. Im Gallindex zeigten sich kein signifikanten Unterschiede. Gegenüber dem Welkeerreger F. oxysporum f. sp. lycopersici führte Fo162 zu einer ca. 2wöchigen Verzögerung der Welkesymptome.

Biodiversität kartoffelassoziierter Bakterien und ihr antagonistisches Potenzial gegen Meloidogyne incognita

Pflanzenassoziierte Bakterien können das Pflanzenwachstum und die Pflanzengesundheit positiv beeinflussen. Über die Diversität und Abundanz der Bakterien und deren antagonistisches Potenzial gegenüber bodenbürtigen Schaderregern ist bis heute aber erst wenig bekannt. In den vorliegenden Untersuchungen wurden Bakterien aus den Mikrohabitaten Rhizosphäre/Endorhiza und Phyllosphäre/Endosphäre von Kartoffeln der Sorte Cilena isoliert und mittels FAME-GC Analyse identifiziert. Isolate mit Antibiosis gegen Verticillium dahliae wurden im Gewächshaus zusätzlich auf ihre antagonistische Wirkung gegen Meloidogyne incognita getestet. Im Jahre 2000 wurden auf den beiden Standorten Bonn und Rostock insgesamt 730 Bakterien isoliert und 442 Isolate bestimmt. Die Anzahl Bakteriengattungen variierte in Abhängigkeit von Standort und Mikrohabitat und lag in Bonn zwischen 6 (Endosphäre) und 23 (Phyllosphäre) und in Rostock zwischen 8 (Endosphäre) und 16 (Endorhiza). Auf dem Standort Bonn dominierten die Gattungen Pantoea (Rhizosphäre), Pseudomonas und Clavibacter (Phyllosphäre und Endosphäre) sowie Bacillus (Endorhiza), während in Rostock Clavibacter (Rhizosphäre), Micrococcus (Phyllosphäre) und Pseudomonaden (Endosphäre und Endorhiza) bevorzugt auftraten. Bei den Bakterien mit antagonistischer Wirkung gegen M. incognita dominierten Curtobacterium und Streptomyces in der Rhizo- und Phyllosphäre, während in der Endosphäre und in der Endorhiza fast ausschließlich Pseudomonaden als Antagonisten identifiziert wurden. Im Jahre 2001 wurde das Bakterienspektrum an 3 Terminen während der Vegetationsperiode (Aufgang, Blüte, Reife) erfasst. Die Ergebnisse hierzu sind noch in Bearbeitung.

Endophyten der Kartoffel und ihr antagonistisches Potential gegen die pflanzenpathogenen Pilze Verticillium dahliae und Rhizoctonia solani

Pflanzenassoziierte Bakterien sind für die Pflanzengesundheit und das -wachstum von entscheidender Bedeutung. Die Diversität von Kartoffel-assoziierten, gegen die pflanzenpathogenen Pilze Verticillium dahliae und Rhizoctonia solani wirksamen Bakterien, sollte untersucht werden. Besonderes Interesse galt dabei den endophytisch lebenden Bakterien. Der Anteil antifungisch wirksamer Bakterien wurde in Dualkulturtests untersucht. In der Rhizosphäre (10 %) und Endorhiza (9 %) war der prozentuale Anteil der antagonistisch wirksamen Bakterien höher als in der Phyllosphäre (6 %) und Endosphäre (5 %). Die gegen Verticillium dahliae und Rhizoctonia solani antagonistisch wirksamen Isolate wurden durch ihren molekularen Fingerprint mittels BOX-PCR genotypisch charakterisiert. Des weiteren wurden sie durch Sequenzierung ihrer 16S rDNA identifiziert. Es wurden 22 verschiedene antagonistisch wirksame Arten identifiziert. Die aus der Rhizosphäre isolierten Antagonisten waren größtenteils Streptomyceten, die aus der Endorhiza und Endosphäre Pseudomonaden. Die wirksamen Isolate wurden auf ihre antifungischen Mechanismen mittels in vitro Biotests untersucht, wobei insbesondere Konkurrenz und Lyse betrachtet wurden. Ein großer Teil der Isolate verfügte über die Fähigkeit lytische Enzyme (Proteasen, Glucanasen, Cellulasen, Chitinasen) und Siderophoren zu bilden. Nur 7 % der getesteten Isolate bildeten das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure in vitro.

Charakterisierung der Rhizosphärenbakterien Stenotrophomonas maltophilia und S. rhizophilia

Stenotrophomonas-Isolate gehören zu den dominanten Rhizosphärenbakterien vieler Kulturpflanzen und weisen hervorragende Eigenschaften in der biologischen Kontrolle von Pflanzenkrankheiten auf. Allerdings steigt die Bedeutung von S. maltophilia als nosokomiales Pathogen stetig. Parallelen bei der Besiedlung von Eukaryoten durch andere pflanzen- bzw. humanassoziierte Bakterienspezies wurden aufgedeckt. Das Ziel der Untersuchungen besteht in der phäno- und genotypischen Differenzierung der Isolate sowie in der Aufklärung der Mechanismen ihrer Interaktion mit Eukaryoten. Untersuchungen zur Differenzierung von Stenotrophomonas-Isolaten mittels 16S rDNA Sequenzierung führten zur Einteilung in drei verschiedene Genomovare. Durch phänotypische Untersuchungen konnte das Genomovar 1 als neue Spezies Stenotrophomonas rhizophila beschrieben werden. Als wichtiges Merkmal hierfür erwies sich die Synthese von Osmolyten. Das Vermögen zur Osmolytakkumulation ist eine Voraussetzung für die Toleranz wechselnder Wassergehalte. In Stenotrophomonas-Isolaten wurden Trehalose und/oder Glucosylglycerol als Osmolyte identifiziert. Die in vitro Synthese wurde für drei ausgewählte Modellstämme untersucht. Die Aufklärung der molekularen Grundlagen der Osmolytsynthese in einem pflanzenassoziierten Stenotrophomonas-Isolat wird erste Einsichten in einen für die Interaktion von Bakterien und Pflanzen wichtigen Prozess ermöglichen.

Charakterisierung des chitinolytischen Systems des Biological Control Agents Serratia plymuthica strain HRO-C48

Das Rhizosphärenbakterium Serratia plymuthica HRO-C48 wurde für einen Einsatz als Biological Control Agent (BCA) der Erdbeere ausgewählt, da es sich in in vitro Vorversuchen und im Gewächshaus als wirksam erwies. Die antifungische Aktivität dieses Isolats wird haupsächlich über Lysis der Pilzzellwände mittels chitinolytischer Enzyme bewirkt. Das chitinolytische System besteht aus drei Enzymen, die näher charakterisiert wurden. Die Bewertung des Isolats als BCA erfolgte in 3 aufeinanderfolgenden Freilandversuchen, die im kommerziellen Erdbeeranbau integriert waren. Hierfür wurden Pathogen-haltige Böden genutzt. Die Bakterien wurden im Tauchbadverfahren unmittelbar vor der Pflanzung ausgebracht. S. plymuthica reduzierte die Symptome der Verticillium Welke von 0 bis 37.7%, im Durchschnitt um 24.2% und bewirkte somit ein Ertragssteigerung von 156 bis 394%, im Durchschnitt um 296%. Die Serratia-Behandlung reduzierte auch den Befall mit Phytophthora von 1.3 bis 17.9%, im Durchschnitt um 9.6% verbunden mit einem Ertragsanstieg von 60% verglichen mit der unbehandelten Kontrolle. S. plymuthica erwies sich unter Freilandbedingungen als rhizosphärenkompetent; Lebendkeimzahlen von log₁₀ 3-7 CFU/g Wurzel wurden über einen Zeitraum von bis zu 14 Monaten ermittelt.

Einfluß der Motilität, Adhäsion und der Bildung von Siderophoren und Antibiotika von Ps. fluorescens B5 und Ps. corrugata R117 auf die Rhizosphärenbesiedlung und die antagonistische Wirkung im Microcosmen-Versuch

Die Verwendung der Microcosmen gestattete es, die Untersuchungen zur Wurzelbesiedlung unter konstanten Bedingungen (T, pH, Matrixpotential, VWC) durchzuführen. Die Verwendung lux-markierter Rhizosphärenbakterien ermöglichte zudem die Quantifizierung der Wurzelbesiedlung und Aktivitätsbestimmung der Pseudomonaden durch Messung der Biolumineszenz. Es konnte eine hohe Korrelation zwischen der CFU und der Biolumineszenz festgestellt werden. Zur Überprüfung der Bedeutung der Motilität, Adhäsion, Siderophoren und Antibiotika der Pseudomonaden an der Pathogenabwehr im System Antagonist-Boden-Pflanze-Pathogen wurden Tn10-Insertionsmutanten hergestellt und im Microcosmen-Versuch getestet. Eine reduzierte, bzw fehlende Siderophorenbildung führte zu einer geringerer Besiedlung und Biolumineszenz. Ebenfalls war die Biocontrol-Aktivität der Pseudomonaden deutlich erniedrigt. Die fehlende antagonistische in vitro Wirkung gegenüber P. ultimum führte besonders bei Ps. fluorescens zu einer geringeren Wurzelbesiedlung und Biolumineszenz. Zudem ist die antagonistische Wirkung ad planta für beide Pseudomonaden stark eingeschränkt. Die Besiedlung und Biolumineszenz wurde hingegen bei beiden Pseudo­monaden erhöht, wenn Mutanten mit reduzierter in vitro Motilität eingesetzt wurden. Die Biocontrol-Aktivität der Antagonisten wurde nicht beeinflusst. Die Verwendung von Mutanten mit in vitro signifikant reduzierten Adhäsionseigenschaften an Zuckerrübenwurzeln zeigte keine negativen Effekte auf die Besiedlung. Bei Ps. fluorescens B5 wurde sogar eine Verbesserung der Besiedlung und Biolumineszenz beobachtet. Die Biocontrol-Aktivität war nur bei Ps. corrugata R117 geringfügig eingeschränkt. gefördert von der EU (1998-2001): FAIR PL1373: Improvement of Biological Seed Treatments against Damping-Off in Crop Production.

Der pflanzenwachstumsfördernder Wurzelendophyt Piriformospora indica: Vergleich mit arbuskulären Mykorrhizapilzen

Piriformospora indica wurde als Mykoparasit aus der Spore eines arbuskulären Mykorrhizapilzes isoliert. Da sich herausstellte, dass er in der Lage ist, Pflanzenwurzeln zu besiedeln, sollte diese Wechselwirkung weiter untersucht werden. Inokulierungen verschiedener Pflanzen zeigten einen wachstumsfördernder Effekt. Außerdem stellte sich heraus, dass P. indica auch die Keimung von Orchideen ermöglicht und die Regeneration aus Kalluskulturen positiv beeinflußt. Durch Sequenzierung der 18 S rRNA und mit Hilfe der Elektronenmikroskopie des Porus konnte er der Formgattung Rhizoctonia (Basidiomycaota, Hymenomycetes) zugeordnet werden. Nähere cytologische Untersuchungen zeigten, dass der Pilz den Cortex der Wurzel sowohl inter- wie intrazellulär besiedelt. Dabei wurden die verschiedenen Myzelstrukturen allerdings nur in toten Gewebeteilen gefunden. Die Ursachen für den wachstumsfördernden Effekt sind zur Zeit noch unbekannt. Sie könnten wie bei den Mykorrhizapilzen in der verbesserten Nährstoffversorgung, in der Beeinflussung des Phytohormonhaushalts oder in einem Schutz vor abiotischen und biotischen Stress begründet sein. Um die Untersuchungen der Wechselwirkungen zu erleichtern, wird zur Zeit ein Transformationssystem für P. indica entwickelt. Als Quelle für den Promotor soll dabei das stark exprimierte Gen Pitef1 dienen, das für den Translationselongationsfaktor EF-1alpha kodiert.

Wirkung von Waidextrakten auf samenbürtige Pilze

Entwicklung eines Gewächshaus-Screeningverfahrens auf Aktivität gegen Tilletia caries

Der Weizensteinbrand, hervorgerufen durch Tilletia caries (DC.) Tul., gehört potentiell zu den wichtigsten Krankheiten des Weizens, bei konsequenter Verwendung geeigneter Saatgutbehandlungsverfahren stellt diese Krankheit allerdings kein Problem dar. Das Screening zum Auffinden wirksamer Saatgutbehandlungsmittel erfolgt in der Regel an Winterweizen im Feld. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens ist der lange Zeitraum (ca. 6 - 8 Monate) zwischen der Aussaat und Bonitur des Ährenbefalls. Bei Durchführung des Screenings im Gewächshaus und Bonitur anhand der Frühsymptome von T. caries lässt sich dieser Zeitraum auf ca. 6 Wochen verkürzen. In eigenen Versuchen wurde die (Labor)Sommerweizensorte Apogee verwendet, prinzipiell sind aber auch hochanfällige Winterweizensorten geeignet. Das Saatgut wurde mit Sporen von T. caries (1-2 g/kg) inokuliert, mit Suspensionen potentieller Antagonisten besprüht und in Töpfe ausgesät. Die Töpfe wurden 20 bzw. 10 Tage lang bis zum Erscheinen der Koleoptilen bei 4 bzw. 15 °C aufgestellt und anschließend in einen klimatisierten Raum (20 °C, 16h Licht) überführt. Ab dem 1-2 Blattstadium wurden auf Blattspreiten und Blattscheiden die unscheinbaren, punktförmig-flächigen Symptome der Infektion mit T. caries sichtbar. Im Bereich der Symptome ließ sich der Pilz mikroskopisch nachweisen. Nach unseren Beobachtungen entwickeln nicht alle Pflanzen mit Frühsymptomen auch Ährenbefall (Sortenresistenz), aber dem Ährenbefall gehen stets Frühsymptome voraus. In den Kontrollen war der Befall bei Ablauf der Keimung bei 4 °C höher als bei 15 °C. Die Wirksamkeit der besten bisher gefundenen Antagonisten lag bei ca. 80 %. Sie war bei 15 °C besser als bei 4 °C.

Screening von Mikroorganismen und Pflanzenextrakte auf Aktivität gegen Phytophthora infestans

Biologische Bekämpfung von Leptosphaeria maculans, dem Erreger der Wurzelhals- und Stängelfäule an Winterraps

Basierend auf dem in vitro Screening wurden 21 bakterielle Antagonisten (u. a. Bacillus circulans, B. subtilis, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens, Serratia plymuthica, Erwinia herbicola) auf ihre ad planta Hemmwirkung gegen L. maculans zuerst an Rapskeimlingen der anbauüblichen Sorte `Express? untersucht, wobei die Keimlinge unmittelbar nach der Keimblattverletzung mit den Antagonisten besprüht wurden. Die Infektion mit L. maculans erfolgte 6-8 Stunden später. Alle getesteten Antagonisten konnten den Pflanzenbefall (21 dpi) mit L. maculans unterdrücken. Pseudomonas fluorescens Gö2I, Kar1 und RII2, Paenibacillus polymyxa HA3e, Bacillus circulans Kom1 und Kom19 erzielten dabei Wirkungsgrade von 50% bis 80 %. Zur Überprüfung der Wirksamkeit der Antagonisten an den typischen Eintrittspforten, Wurzelhals und Stängelbasis, für L. maculans wurde eine naturnahe Infektionsmethode nach Vergleich verschiedener Inokulumarten (Myzel, Pyknosporen und Ascosporen), Entwicklungsstadien und Inokulationsstellen entwickelt, in der die Rapspflanzen in BBCH14/15 an der Stengelbasis mit Pyknosporen inokuliert wurden. Verglichen mit der Vorselektion an Rapskeimlingen konnten für die Isolate HA3e, RII2 und Kom19 nahezu identische Ergebnisse erzielt werden. Die Befallsquantifizierung erfolgte durch Sichtbonitur und anhand eines zuvor entwickelten DAS-ELISA. Der Bekämpfungserfolg durch die Kombination von Ps. fluorescens RII2 mit Bacillus sp. HA3e konnte signifikant gesteigert werden. HPLC-analytisch wurde die Bildung des Antibiotikums Pyrrolnitrin durch Ps. fluorescens RII2 nachgewiesen, welches eine fungizide Wirkung gegenüber dem Myzelwachstum von L. maculans zeigte.

Optimierung von Prozessparametern zur Produktion von Mikroorganismen für den Pflanzenschutz

Die Entwicklung marktfähiger biologischer Pflanzenschutzmittel auf der Basis von Mikroorganismen erfordert die Massenproduktion von Biomasse mit hoher Qualität zu konkurrenzfähigen Preisen. Die Prozeßoptimierung ist ein notwendiger Schritt auf dem Weg zur Kommerzialisierung. Ziele der Prozeßoptimierung ist eine Reduktion der Prozeßzeit bei gleichzeitiger Erhöhung der Ausbeute, wobei die Qualität des Produkts während des gesamten Optimierungsprozesses berücksichtigt werden sollte. Zu Beginn steht eine Medienoptimierung, an die sich die Optimierung der Prozeßparameter (z.B. °C, pH, pO2, pCO2, rpm, vvm. etc.) anschließt. Kontinuierliche Prozeßbedingungen können den Fortschritt der Optimierung erheblich beschleunigen. Fed-batch Bedingungen dienen der Steigerung der Zellmasse oder Produktion wirkungsrelevanter Metabolite. Erhebliche Kostenreduktionen sind durch scale-up der Produktionskapazitäten zu erreichen, bei gleichzeitiger Senkung der Medienkosten. Am Institut stehen Bioreaktoren im Labormaßstab für kontinuierlichen und batch-Betrieb zur Verfügung, mit Möglichkeiten zur on-line Erfassung der Prozeßparameter und Abgasanalyse mittels Massenspektrometer. Off-line stehen Analysegeräte (HPLC, FPLC, GC, Photometer) zur Verfühung zur Quantifizierung von Metaboliten. In Zusammenarbeit mit dem Industriepartner E-Nema GmbH können scale-up Schritte von 10 bis 7.000 ltr. durchgeführt werden.

Entwicklung einer Formulierung für Biological Control Agents

Der biologische Pflanzenschutz bietet effiziente und umweltfreundliche Lösungen zur Abwehr von Pflanzenpathogenen. Zahlreiche Beispiele belegen die Wirkung von antagonistischen Rhizosphärenbakterien bei der Bekämpfung von bodenbürtigen Pathogenen. Ein Problem für die Produktentwicklung stellt die Formulierung der Biological Control Agents (BCAs) dar. Während für Gram-positive Bakterien, die Sporen als Überdauerungsorgane bilden, mehrere Alternativen bestehen, ist die Formulierung von Gram-negativen Bakterien bislang nur unzureichend möglich. In diesem Projekt wurden 3 neue Formulierungen für die BCAs Serratia plymuthica HRO-C48 und Pseudomonas sp. L-29-1-8 evaluiert. Für die Bewertung wurde ein kombinierter Methodenansatz genutzt, der in vitro und in vivo Methoden einschloss. Über einen Zeitraum von 3 Monaten wurde die Überlebensrate, die Aktivität und die genetische Stabilität der Bakterien geprüft. Die Formulierungen zeigten für die beiden BCAs eine unterschiedliche Wirkung. Für Serratia plymuthica HRO-C48 erwies sich eine Flüssigformulierung als geeignet, während für Pseudomonas sp. L-29-1-8 eine Festformulierung ausgewählt wurde.

Der nematophage Pilz Hirsutella rhossiliensis: Fermentation im 5-Liter Rührreaktor und Formulierung in Kapseln und Zuckerrübenpillen

Trotz einer Reihe von Ansätzen gibt es für den nematophagen Pilz Hirsutella rhossiliensis noch kein wirksames Präparat zur biologischen Bekämpfung von pflanzenparasitären Nematoden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass für eine technische Nutzung dieses Pilzes entsprechende Fermentations- und Formulierungsverfahren noch nicht entwickelt worden sind. Hier werden Arbeiten zur Anzucht im Bioreaktor und zur Formulierung in Kapseln und Zuckerrübenpillen vorgestellt.

Fermentation

Ziel der Untersuchungen ist die Anzucht von fein dispersem Pilzmyzel, welches im Vergleich zu Pellets eine höhere Vitalität aufweist und zudem leichter zu verarbeiten ist. Hier ist es erstmals gelungen, im 5-L Rührreaktor in einem Glucose/Hefextrakt-Medium fein disperses Myzel (5,0 g/L Biotrockenmasse nach 50 h) zu produzieren.

Formulierung

a) Kapseln
Eine Vielzahl von systematischen Untersuchungen zur Verkapselung von Pilzmyzel zusammen mit Nährstoffen resultierte in einer Kapsel, die lediglich 1 % Biofeuchtmasse und Nährstoffe enthält und in Pathogenitätstests gegen Heterodera schachtii an Zuckerrübe auch bei einer Wiederholung Befallsreduktionen um 80 % bewirkte.

b) Pillierung
Hier werden erste Ergebnisse zur Etablierung eines Prozesses, bei dem Pilzmyzel in eine kommerzielle Zuckerrübenpille eingearbeitet wird, vorgestellt (Prozessdaten, Pillencharakterisie-rung): Dabei werden am Dragierkessel 80 g Zuckerrübensamen mit Hüllmasse und Kleberlösung pilliert. Die Aufwandmenge beträgt umgerechnet nur 25 g Biotrockenmasse für 1 U (100.000 Samen). Insbesondere die hohe Wirksamkeit und scale-up-fähige Produktionstechnologie lassen eine Anwendung von Hirsutella rhossiliensis zur biologischen Bekämpfung von pflanzenparasitären Nematoden aussichtsreich erscheinen.

Integration antagonistischer Bakterien in den Pillierungsprozess von Zuckerrüben-Saatgut - Ergebnisse und Probleme

Phytopathologischen Problemen, die bei Keimung und Feldaufgang von Zuckerrüben (ZR) entstehen können, wird in der konventionellen Landwirtschaft durch Saatgutbehandlung mit chemischen Fungiziden (v.a. Wirkstoffe Thiram, Hymexazol) und Insektiziden (Wirkstoffe v.a. Imidacloprid, Tefluthrin) begegnet. Untersuchungen bei KWS zielen im Rahmen eines EU-Projektes (Improvement of biological seed treatment against damping-off in crop production) sowie weiterer Kooperationsprojekte (FZB Biotechnik/Berlin, BioAgri/Uppsala u.a.) darauf ab, Aussagen darüber zu treffen, inwieweit mikrobielle Antagonisten die Wirkung von Fungiziden ersetzen bzw. ergänzen können. Im Vergleich zu synthetischen Fungiziden besteht der Vorteil mikrobieller Antagonisten in der geringeren Toxizität und länger anhaltender Wirkung. Resistenz von Pathogenen gegenüber chemischen Pflanzenschutz-mitteln (PSM) sowie ein sich gesellschaftlich veränderndes Umfeld (Verbot von Pflanzenschutzmitteln, politische Förderung von integriertem Pflanzenschutz und ökologischer Landwirtschaft) tragen dazu bei, die Entwicklung von Alternativen zu forcieren. Im Rahmen der Versuche im Technikum der KWS kommen vornehmlich bakterielle Antagonisten von Bacillus spp. und Pseudomonas spp. zum Einsatz. Diese werden in die Pilliermasse der ZR-Pille bzw. in eine die Pille umgebende Schutzschicht eingearbeitet. Überprüft wird dabei die Eignung von Pilliermassenbestandteilen hinsichtlich der Wirkung auf die Anlagerung und das Überleben der Mikroorganismen. Neben den mikrobiologischen Parametern muss die mit Antagonisten ausgestattete Pille auch physikalischen (Härte, Rundheit etc.) und biologischen (Keimfähigkeit, Triebkraft etc.) Qualitätsanforderungen entsprechen. Diese Daten werden im Labor ermittelt und sind eine Voraussetzung für die Einführung in die Praxis. Konkretes Ziel der Applikation der Organismen ist die Unterdrückung des Befalls mit Schadpilzen des Wurzelbranderregerkomplexes (v.a Pythium ultimum, Aphanomyces cochlioides, Rhizoctonia solani, Phoma betae), um die besonders sensitive Keim- und Aufgangsphase zu sichern. In Ermangelung eines direkten Nachweises der Unterdrückung von Pathogenen stellt die Bestimmung des Feldaufganges (Früh-, Endzählung) an den meisten der untersuchten Versuchsstandorte den Hauptparameter des Wirkungsnachweises dar. Folgende Kernaussagen lassen sich nach den bisherigen Ergebnissen treffen: Physikalische Eigenschaften der ZR-Pille werden durch Antagonisten nicht negativ beeinflusst. Eine kombinierte Applikation von Mikroorganismen und PSM ist möglich, teilweise auftretende sensitive Reaktionen von Pseudomonas spp. sind zu berücksichtigen. Keimfähigkeit und Triebkraft von ZR-Saatgut können unter Laborbedingungen durch Antagonisten und unterstützende Additive gefördert werden. Antagonisten haben das eindeutige Potenzial, den frühen Aufgang im Freiland zu beschleunigen, die genauen Ursachen (Pathogenunterdrückung, Wachstumsförderung) sind unklar. Höchste Endaufgänge im Feld lassen sich mit der alleinigen Applikation mikrobieller Antagonisten nicht erreichen. Insgesamt zeigt sich, dass - verglichen mit konventionellen, mit PSM ausgestatten ZR-Pillen - Antagonisten keine signifikanten Verbesserungen der untersuchten Parameter bewirken. Für eine integrierte Landwirtschaft (Verminderung von Aufwandmengen von PSM) und für den PSM-freien Ökolandbau besteht jedoch die Perspektive, dass die Applikation von Biologika auf der Basis von Mikroorganismen ein fester Bestandteil des Pflanzenschutzes und der Pflanzenwachstumsförderung wird. Das wichtigste (nicht neue) Ziel für zukünftige Arbeiten sollte in der Verbesserung der Wirkungssicherheit im Feld bestehen.