Arbeitskreis
Phytobakteriologie - Tagung 2002

Titel der Abstracts:

• Der Erreger der Eckigen Blattfleckenkrankheit Xanthomonas fragariae in der In-vitro-Vermehrung von Erdbeeren
• Pseudomonas viridiflava - Erreger einer Blattfleckenkrankheit der Aubergine
• Herausgegriffenes von unseren bakteriologischen Arbeiten in Zusammenhang mit dem Feuerbrand
• Regulation of the phytotoxin coronatine production in P. syringae PG4180 and DC3000
• Genetic analysis of levan synthesis by the plant pathogen Pseudomonas syringae
• Regulation of Coronatine Biosynthetic Genes of Pseudomonas syringae in planta
• Gentechnische Züchtung feuerbrandresistenter Apfelsorten und - unterlagen
• Engineering resistance of pome fruit trees to phytoplasma infection by expression of membrane-specific recombinant antibodies
• Pseudomonas syringae an Zwetschenbäumen - Biologie des Schaderregers und Vermeidungsstrategien
• Untersuchungen zur Überdauerung und Ausbreitung von Ralstonia solanacearum bei Rinnen- und Anstaubewässerung sowie zur Wirksamkeit von Wasserentkeimungsverfahren
• Ausbreitung markierter Erwinia amylovora-Stämme in behandelten Apfelsämlingen
• Prohexadion-Ca gegen Feuerbrand: Update
• Pathogen self-defense against antagonistic biological control agents
• Possible function of a multi-drug efflux pump of E. amylovora in the natural environment
• Bekämpfung des Feuerbrandes mit bakteriellen Antagonisten
• Veränderungen in Populationen von Erwinia amylovora und asiatischen Birnenpathogenen
• Biochemische und genetische Charakterisierung der EPS-Synthese von Erwinia amylovora und Erwinia pyrifoliae
• Gene analysis for classification of two Asian pear pathogens and possible antagonists
• Lysozym eines Erwinia amylovora-Phagen als Inhibitor gram-negativer Bakterien

Moltmann, E., *Herr, R., §Zimmermann, C.; Landesanstalt für Pflanzenschutz, Stuttgart; *Biologisches Labor, Waiblingen; §Universität Hohenheim, Institut für Phytomedizin.

Die Eckige Blattfleckenkrankheit an Erdbeeren verursacht Blattflecken, Verschwärzung der Kelchblätter mit anschließender Fäule der Frucht sowie vereinzelt ein Kümmern der Pflanzen mit Schleimbildung in den Gefäßen des Rhizoms. Nicht nur in der EU sondern auch in vielen anderen Ländern steht die Krankheit auf der Quarantäneliste. Nach ihrer Erstbeschreibung 1959 in den USA breitete sie sich rasch aus und wird heute nahezu weltweit in Erdbeerbeständen nachgewiesen. Der Hauptgrund für die rasche Ausbreitung der Krankheit dürfte die Verbreitung durch latent infizierte Jungpflanzen sein, die visuell nicht von gesunden unterschieden werden können. Erdbeerzuchtbetriebe nutzen für die Vermehrung in frühen Stufen die in-vitro-Technik, um gesundes Pflanzenmaterial zu produzieren. In einem Vermehrungsbetrieb wiesen Erdbeerpflanzen, die direkt aus der in-vitro-Vermehrung stammten, Krankheitssymptome auf. Daher bestand der Verdacht auf einen latenten Befall der in-vitro-Pflänzchen, der mittels Immunfluoreszenstest und PCR bestätigt wurde. Die in-vitro-Pflänzchen können hohe Bakteriendichten enthalten, ohne irgendwelche Symptome zu zeigen. Durch regelmäßige Testung der in-vitro-Kulturen lassen sich befallene Klone frühzeitig eliminieren und so gesundes Pflanzgut produzieren.

Poschenrieder, G.¹, Pollithy, X.², Felgentreu, D.³; ¹ Bayer. Landesanstalt für Landwirtschaft, Institut für Pflanzenschutz, Lange Point 10, D-85354 Freising; ² Landwirtschaftsamt Augsburg/Friedberg, Bismarckstr. 62, D-86391 Stadtbergen; ³ BBA, Institut für Ökotoxikologie u. Ökochemie im Pflanzenschutz, Königin-Luise-Str. 19, D-14195 Berlin.

Anfang April 2002 wurden in einem Auberginen-Jungpflanzenbestand (Sorte 'Madonna') einer Gärtnerei im Raum Rain/Lech Pflanzen mit nekrotischen Blattflecken (bis ca. 1 cm Durchmesser) beobachtet, wobei eine Befallshäufigkeit von ca. 30 % zu verzeichnen war. Im Laufe der Zeit nahm diese weiter zu. Die unregelmäßig geformten, über die gesamte Blattspreite verteilten, später zusammenfließenden und größere Flächen bildenden, häufig durch die Blattadern scharf abgegrenzten Flecken hatten oft einen chlorotischen Hof und waren vorwiegend auf den älteren Blättern zu finden. Einzelne Blattadern waren teilweise verbräunt. Die befallenen Pflanzen mussten "durchgeputzt" werden, was einen erheblichen Blattverlust zur Folge hatte. Ab Mai 2002 fielen bei einem Auberginen-Ertragsbestand (Sorte 'Diva') eines Gartenbaubetriebes im Gundelfinger Gemüsebaugebiet zahlreiche Pflanzen (Befallshäufigkeit ca. 80 %) mit sehr ähnlichen Symptomen auf. In den Sommermonaten erholte sich jedoch dieser Bestand, und die befallenen Blätter wurden bald überwachsen. Am Neuzuwachs waren keinerlei Symptome mehr zu erkennen. Während aus den Blattflecken keine pathogenen Pilze isolierbar waren, ließen sich regelmäßig und reichlich Bakterienisolate gewinnen, die auf King's B-Agar fluoreszierten, auf YDC-Agar eine blaugrüne Pigmentierung aufwiesen und den Agar allmählich bräunlich verfärbten. Aufgrund ihrer Kultur- und physiologischen Eigenschaften konnten die Isolate als Pseudomonas viridiflava identifiziert werden. Die Diagnose wurde durch eine Analyse der zellulären Fettsäuremethylester(FAME)-Profile mit dem Microbial Identification System (MIS) bestätigt. Durch die ständige Überkopfberegnung der Auberginen-Bestände wurden offensichtlich optimale Infektionsbedingungen geschaffen. Dies begünstigte wohl die Erregerausbreitung. Auffallend war, dass gerade während der jungen Entwicklungsstadien stärkerer Befall auftrat.

Vogelsanger, J., FAW, CH-8820 Wädenswil, Schweiz.

In den Jahren 2001 und 2002 war der Feuerbrandbefall in Kernobstanlagen wieder etwas zurückgegangen, Cotoneaster und Weissdorn waren etwas stärker betroffen als in früheren Jahren.
Feuerbranddiagnose: In den beiden Feuerbrandlabors der Schweizerischen Forschungsanstalten FAW und RAC wurden im Jahre 2002 über 3000 Verdachtsproben untersucht, 560 davon waren feuerbrandpositiv. Die Diagnose erfolgte durch Erregerisolation auf die Nährböden King's B und NSA. Die levanpositiven Kolonien auf NSA wiesen nicht immer die typische Koloniencharakteristik auf, sie hatten oft ein erhobenes Zentrum und flache Ränder. Mit der Verwendung beider Medien King's B und NSA war E. amylovora jedoch zu erkennen. Zur Nachtestung wurde ein Serumtest mit Mikropräzipitation verwendet.
Monitoring - Versuch: Eine im Vorjahr vom Feuerbrand befallene Böschung von C. dammeri wurde im darauffolgenden April bis Juni wöchentlich beprobt. Von alten Cankern und von Blüten wurden Isolationen durchgeführt. Erst ab Anfang Juni konnte E. amylovora auf Blüten nachgewiesen werden. Zwei Wochen später brach die Krankheit plötzlich stark aus. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass der von C. dammeri ausgehende Infektionsdruck erst nach der Obstblüte ansteigt. Trotz des späteren Anstiegs des Infektionsdruckes gilt C. dammeri als Wirtspflanze mit Verbreitungs-potential. (Schweiz.Z. Obst-Weinbau 10/02, www.feuerbrand.ch/bek/dammeri/monitori.htm)
Untersuchung von E. amylovora - Isolaten auf Streptomycinresistenz: Die Untersuchung sollte abklären, ob in einem Gebiet ohne bisherigen Streptomycineinsatz gegen Feuerbrand resistente Stämme auftreten. Untersucht wurden 175 Isolate von E. amylovora. Es wurde mit 20, 50 und 100mg Streptomycinsulfat pro ml Nährmedium getestet. Keiner der getesteten Isolate war als ganze Kultur gegenüber Streptomycin resistent. Spontanmutationen einzelner Bakterien mit Resistenz gegenüber Streptomycin wurden im Labor beobachtet, was jedoch ein bekanntes Phänomen ist.
Blütenversuche: Es wurde untersucht, ob sich unter Laborbedingungen mit Versuchspräparaten die epyphytische Vermehrung von E. amylovora abstoppen liesse. Die Ergebnisse wiesen noch eine zu grosse Streuung zwischen einzelnen Blüten auf, die Methode wird weiterverfolgt. Über die Entwicklung von E. amylovora auf Blüten wurden bereits Untersuchungen durchgeführt (Schweiz. Z.Obst.Weinbau 13/01).

Smirnova, A.V., Schneider, B., and Ullrich, M.S.; International University Bremen, School of Engineering and Sciences, Campusring 1, D-28759 Bremen.

A modified two-component regulatory system consisting of two response regulators, CorR and CorP, and the histidine protein kinase CorS, regulates the thermoresponsive production of the phytotoxin coronatine (COR) in P. syringae PG4180, which is the causal agent of bacterial blight of soybean. COR is produced at the virulence-promoting temperature of 18°C but not at 28°C, the optimal growth temperature of PG4180. The genome sequencing project of P. syringae DC3000, which a tomato plant pathogen, has revealed the presence of the CorRSP system in this strain as well. However, COR is produced by DC3000 in a temperature-independent manner. When provided in trans, a 3.4-kb fragment bearing corR, corS, and corP genes from PG4180 established a thermoresponsive COR production in DC3000 as well as in a corS knock-out mutant of DC3000. The same fragment could restore a temperature-dependent COR production and transcriptional activation of the cmaABT promoter in a transposon corS-, corR- mutant of PG4180 (D4). In contrary, when a 3.4-kb fragment bearing corR, corS, and corP genes from DC3000 was introduced in trans to the mutant D4, COR was produced by the transconjugant at the level of COR production in DC3000. We suggest that PG4180-specific sequence alteration in the CorRSP system and particularly, in the sequence of corS gene encoding for a temperature sensor kinase, might be responsible for temperature-dependent production of COR by Pseudomas syringae strains.

Li, H., Schenk, A, and Ullrich, M.S.; International University Bremen, School of Engineering and Sciences, Campusring 1, D-28759 Bremen.

In the plant pathogen Pseudomonas syringae pv. glycinea PG4180 and other bacterial species, synthesis of the exopolysaccharide levan is catalyzed by the extracellular enzyme levansucrase (Lsc). Southern blot and PCR analysis indicated the presence of three levansucrase-encoding genes in PG4180: lscA, lscB, and lscC. In this study, lscB and lscC were cloned from a genomic library of strain PG4180. Sequence analysis of both genes showed that they were virtually identical to each other and highly similar to the previously characterized lscA gene. lscA and lscC had a chromosomal location whereas lscB resided on an indigenous plasmid of PG4180. Comparison of extracellular protein profiles of P. syringae pv. glycinea PG4180 grown in minimal medium at 18°C and 28°C revealed a protein band corresponding to levansucrase which was predominantly found in the supernatant at 18°C. Mutants impaired in expression of individual lsc genes as well as double mutants were generated by marker exchange mutagenesis. Determination of levansucrase activities in these mutants revealed that the lscB gene product but not that of lscA or lscC was secreted at 18°C. Our results indicated that lscB and lscC but not lscA contributed to periplasmic levan synthesis of PG4180. The lscB lscC double mutant was completely defective in levan formation and could be complemented by either lscB or lscC. Data of this study suggested a compartment-specific localization of two lsc gene products with LscB being the secreted and LscC being the predominantly periplasmic levansucrase. Results of Western blot analyses indicated that lscA was not expressed and that it could only be detected in PG4180 when transcribed from the vector-borne Plac promoter. Transcriptional fusions of either lsc gene to a promoterless glucuronidase gene (uidA) were constructed and quantified indicating that transcription of the lsc genes was not temperature-dependent. PCR screening with primers derived from the three characterized lsc genes demonstrated the presence of multiple Lsc isoenzymes in other P. syringae pathovars.

Weingart, H., Ullrich, M.S.; International University Bremen, School of Engineering and Sciences, Campusring 1, 28759 Bremen.

Coronatine (COR) is a chlorosis-inducing phytotoxin produced by Pseudomonas syringae. Although COR is a major virulence factor of P. syringae, little was known about the expression of biosynthetic genes required for COR production in planta. Confocal laser scanning microscopy was used to investigate the in vitro and in planta expression of COR genes by P. syringae pv. glycinea PG4180, a pathogen of soybeans, and P. syringae pv. tomato DC3000, a pathogen of crucifers. Previously, it was shown in vitro that the cmaABT operon of P. syringae pv. glycinea PG4180 involved in COR synthesis is expressed in a temperature-dependent manner with maximal rates at 18°C and low activity at 28°C. Therefore, a transcriptional cmaABT::egfp fusion was constructed and the resulting plasmid pHW1 was transferred to both P. syringae strains. Quantitation of fluorescence indicated that COR biosynthesis by P. syringae pv. glycinea PG4180(pHW01) is temperature-dependent in minimal medium as well as inside the plant tissue. However, transcription of the cmaABT operon was not significantly affected by temperature in P. syringae pv. tomato DC3000(pHW01). In contrast, DC3000(pHW01) showed higher levels of fluorescence when re-isolated from infected host plants as compared to DC3000(pHW01) grown in minimal medium. These results indicate that the signals for induction of COR biosynthesis differ in PG4180 and DC3000.

Hanke, V., Richter, K. und Geider, K.; BAZ Dresden-Pillnitz und Aschersleben, MPI für Zellbiologie, Ladenburg.

Die biologische Bekämpfung des Feuerbrands ist in letzter Zeit durch Transformation von Apfel- und Birnensorten durch Gene versucht worden, deren Produkte gegenüber Erwinia amylovora eine Hemmwirkung haben können. Dazu gehören Saponin-ähnlich Proteine aus Insekten (Attacin, Cecropin), Lysozym aus Bakteriophagen und Hühnereiweiß und die Erhöhung der pflanzlichen Resistenz durch die Expression von Harpin aus E. amylovora oder Pektatlyasen aus Weichfäule-Erwinien.
Eine weitere Ansatz wurde durch Abbau der Amylovoran-Kapsel von E. amylovora im Pflanzengewebe versucht. Das verantwortliche Gen für eine EPS-Depolymerase stammte ebenfalls aus einem E. amylovora-Phagen und wurde zur besseren Proteinreinigung mit einem His-tag versehen. Im Fluoresenz-Mikroskop kann man den enzymatischen Abbau der Kapsel erkennen. Auf Birnenscheiben, die mit dem Protein vorbehandelt wurden, kann sich der Feuerbranderreger kaum oder bei geringer Inokulationsmenge gar nicht vermehren. Die Expression der EPS-Depolymerase wurde über den CaMV35S-Promotor in Apfel erzielt und durch Southern-blots (DNA), Northern blots (mRNA) und Western-blots (Protein) nachgewiesen. Die positiven Ergebnisse wurden durch PCR-Analysen bestätigt. Von zahlreichen Blattsegmenten, die mit A. tumefaciens und einem binären Vektor transformiert waren, wurden aus verschiedenen Apfelsorten einige Hundert Pflanzen regeniert. Im Resistenztest durch gfp-markierte E. amylovora-Stämme war die Sorte 'Pinova' unterschiedlich resistent, und transgene 'Malus robusta' zeigten kaum noch Ausbreitung des Feuerbranderregers. Durch Verbesserung in der Expression des EPS-dpo Gens, oder durch Verbindung mit Signalproteinen für die gezielte Lokalisierung in der Apfelzelle könnte die Resistenzbildung noch weiter verbessert werden.

Schneider, B.¹, Seemüller, E.¹, Fischer, R.²; ¹ Biologische Bundesanstalt, Institut für Pflanzenschutz im Obstbau, Schwabenheimerstr. 101, 69221 Dossenheim, Germany. ² Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule, Institut für Biologie VII, Worringerweg 1,·52074 Aachen, Germany.

Phytoplasmas are unculturable plant pathogenic bacteria belonging to the class Mollicutes. They are phloem-restricted and transmitted by phloem-feeding insects. In southern Germany apple proliferation (AP) disease is widespread. Recently, two psyllid species (Cacopsylla costalis and C. melanoneura) were identified as AP vectors. The disease is difficult to control because all commonly grown apple cultivars and rootstocks are susceptible to infection, and reduced insecticide treatment practised by the integrated pest management may fail to control the psyllid vectors. Due to this unsatisfactory situation an alternative approach was initiated. In 1993, Tavladoraki et al. showed that plant-expressed recombinant antibodies (scFv-fragments) specific to a viral coat protein of the artichoke mottled crinkle virus was able to reduce virus multiplication. Work by other researchers expressing scFv-fragments against viral or bacterial target proteins gave evidence that pathogen numbers were reduced and/or symptoms delayed. Berg et al. (1999) identified an immunodominat membrane protein of the AP phytoplasma, designated 318B. The function of this protein is unknown but the amount present in infected plants suggests an important role in the pathogens' life cycle. Therefore, this protein was selected as target molecule.
By phage display technology scFv-fragments specifically binding to membrane protein 318B were selected. E. coli-expressed scFv fragments revealed that the antibody fragment is functional in Western blot and ELISA experiments and recognized the native protein 318B from infected plants. One of the scFv fragments was then subcloned into a binary vector and stable transformed tobacco plants were generated by agrobacterium-mediated transformation. Two promoters were used for plant expression, the 35S cauliflower mosaic virus promoter and a phloem-specific promoter from coconut foliar decay virus. Both promoters showed activity in regenerated tobacco plants and scFv-fragments were detected in Western blot assays. To evaluate the effect of the in-vivo expressed scFv-fragments on the viability of the AP phytoplasma, grafting experiments of AP-infected material onto transgenic tobacco plants were performed. Evaluation of the grafting experiments are ongoing as offspring generations of the parental lines are examined.

Tavladoraki, P., Benvenuto, E., Trinca, S., De Martinis, D., Cattaneo, A. and Galeffi, P. 1993. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack. Nature 366: 469-472.

Berg, M., D.L. Davies, M.F. Clark, H.J. Vetten, G. Maier, C. Marcone, and E. Seemüller. 1999. Isolation of the gene encoding an immunodominant membrane protein of the apple proliferation phytoplasma, and expression and characterization of the gene product. Microbiology/SGM 145:1937-1943.

Hinrichs-Berger, J., Landesanstalt für Pflanzenschutz, Stuttgart.

In den letzten Jahren treten in Baden-Württemberg und anderen Regionen mit intensivem Zwetschenanbau verstärkt Absterbeerscheinungen an Zwetschenbäumen auf. Ursache für den mittlerweile wirtschaftlich bedeutenden Schaden ist in den meisten Fällen das Bakterium Pseudomonas syringae mit seinen Pathovaren Syringae und Morsprunorum.
Der Schaderreger kommt als Epiphyt nicht nur auf seinen Wirtspflanzen, sondern auch auf anderen Pflanzen vor, ohne einen Schaden hervorzurufen. Zum Absterben des Baumes kommt es, wenn P. syringae in den Stamm eindringt, sich stammumfassend ausbreitet und durch die Zerstörung des Leitgewebes die Krone von der Nährstoffversorgung abschneidet. Aufgrund ihres geringen Stammumfangs sind junge Bäume besonders vom Absterben bedroht.
Zu den gefährlichen Stamminfektionen kommt es vor allem im Herbst mit dem Einsetzen der ersten Fröste. Die Pseudomonaden, die zu diesem Zeitpunkt in großer Zahl auf der Oberfläche des Baumes vorhanden sind, nutzen kleinste Frostrisse als Eintrittspforte in den Baum. Aufgrund der reduzierten Stoffwechselaktivität zu Vegetationsende und während der Vegetationsruhe kann sich der Zwetschenbaum nicht mehr gegen eine Infektion wehren. P. syringae vermehrt sich dagegen noch bei Temperaturen von 1 °C und breitet sich insbesondere nach Frösten leicht im Baum aus. Daher sind dicht aufeinander folgende Frost-Wärme-Perioden im Winter besonders günstig für eine Pseudomonas-Infektion des Baumes.
Wie Gewächshausversuche und Erhebungen im Freiland gezeigt haben, gibt es Unterschiede in der Pseudomonas-Anfälligkeit zwischen den Sorten und haben die Unterlagen einen Einfluss auf den Befallsverlauf. Allerdings sind keine hoch resistenten Sorten-Unterlagen-Kombinationen vorhanden. Schnittmaßnahmen im Winter wie eine unausgewogene Nährstoffversorgung erhöhen ebenfalls das Infektionsrisiko.
Da P. syringae als Epiphyt ubiquitär vorhanden ist, systemisch wirksame Bakterizide nicht existieren und die Infektion sehr von den Umweltbedingungen und der obstbaulichen Produktionstechnik abhängt, ist diese gefährliche Zwetschenerkrankung nur durch integrierte Maßnahmen zu kontrollieren. Dazu gehören die Wahl weniger anfälliger Sorten und Unterlagen, eine ausgewogene, angepasste Düngung unter Verzicht von Stickstoffgaben nach der Blüte, keine Schnittmaßnahmen im Winter, Weißeln der Stämme bis in die Krone unter Beimischung von Kupferpräparaten vor dem ersten Frost im Herbst, Ausschneiden von Befallsstellen während der Vegetationsperiode. Strategien zur Kontrolle von P. syringae können nur durch eine Kombination der oben genannten Maßnahmen erfolgreich sein.

Wohanka,W., Forschungsanstalt Geisenheim, Von-Lade-Str. 1, 65366 Geisenheim

Eine Ausbreitung von Ralstonia solanacearum über das Gießwasser konnte bei Rinnen- oder Ebbe/Flutbewässerung von Pelargonien nicht nachgewiesen werden. Obwohl von künstlich inokulierten Pflanzen eine gewisse Kontamination des Gießwassers ausging, reichte dies offensichtlich nicht aus, um die im selben Wasserkreislauf stehenden Pflanzen nennenswert zu infizieren und Krankheitssymptome hervorzurufen.
In einem weiteren Versuch ohne Wirtspflanzen und praxisunüblich hoher Kontamination der Nährlösung mit R. solanacearum (1,1x106 bis 1,4x106 KBE/ml) wurden die Wasserentkeimungsverfahren UV-Bestrahlung (Typ: GDS 1/200, MARTIN Systems AG) und Langsamfiltration (300 L/m2h) verglichen. Während mit der Langsamfiltration lediglich ein durchschnittlicher Wirkungsgrad von 94,9 % erreicht werden konnte, führte die UV-Bestrahlung mit ca. 2400 J/m2 zu einer vollständigen Eliminierung des Erregers.
Die Inokulation steriler und unsteriler Nährlösungen aus einem Ebbe/Flut-System zeigte, dass die Überlebensfähigkeit von R. solanacearum unter Praxisbedingungen auf etwa 3 bis 5 Wochen begrenzt ist. Wurde die Nährlösung hingegen sterilisiert, fand eine Vermehrung des Erregers statt, der dann selbst nach 35 Tagen noch in hoher Dichte nachweisbar war.

Geider, K., Bogs, J., *Spinelli, F., §Rademacher, W. und $Hanke, V.; Max-Planck-Institut für Zellbiologie, 68526 Ladenburg; *Universität Bologna; §BASF Limburger Hof; $BAZ, Dresden-Pillnitz.

Der Feuerbrand bei Kernobst verursacht Nekrosen und bei feuchter Witterung auch Schleimtröpfchen an den erkrankten Pflanzenteilen. Isolate von Erwinia amylovora aus verschiedenen Befallsgebieten können u. U. durch Analyse der "short sequence DNA repeats" (SSRs), oder durch PFGE voneinander unterschieden werden.
Zur Erkennung von E. amylovora im Pflanzengewebe wurden Markierungen durch Biolumineszenz-Gene und vor allem durch gfp (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP) verwendet. Damit werden Bakterien in Leitgefäßen (Xylem) und im Parenchym sichtbar. Aus der Wanderungsgeschwindigkeit und dem Umfang der Besiedlung lassen sich Rückschlüsse ziehen auf die Virulenz der Bakterien bzw. die Resistenz der verwendeten Pflanze gegen Feuerbrand. Nicht-pathogene Stämme bleiben an der Inokulationsstelle sitzen, gering virulente E. amylovoras breiten sich wenig aus. Wurden Apfelsämlinge mit Prohexadion-Ca vorbehandelt, dann waren die gfp-markierten Bakterien im Vergleich mit unbehandelten Pflanzen in ihrer Ausbreitung verzögert. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Apfelsämlingen beobachtet, die mit BION oder 2,6-Dichloro-iso-Nikotinsäure vorbehandelt waren. Es wurden mit dieser Methode auch transgene Apfelpflanzen untersucht, die das EPS-Depolymerase-Gen eines E. amylovora-Phagen exprimierten. Bei Malus robusta und der Sorte 'Pinova' wurden im Vergleich zu den Elternpflanzen eine Verringerung der Ausbreitung von E. amylovora beobachtet. Mit gfp-markierten E. amylovora-Stämmen wurde auch die Besiedlung von Apfelblüten durch den Feuerbranderreger ermittelt.

Rademacher, W., Hauptmann S. und Stammler, G.; BASF Agrarzentrum, 67114 Limburgerhof.

Seit mehreren Jahren ist belegt, dass Prohexadion-Ca (ProCa) bei einer Reihe von Kulturpflanzen zu einem deutlich reduzierten Befall mit Pathogenen führt ohne eine eigene fungizide oder bakterizide Wirkung aufzuweisen. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Wirkung gegen Feuerbrand im Kernobst-Anbau, da hier Antibiotika zunehmend als sehr kritisch gelten und geeignete Alternativpräparate nicht verfügbar sind. Mit den Wachstumsregulatoren APOGEE® und REGALIS® (WGs mit 27,5 bzw. 10 % Gehalt an ProCa) sind bislang weit mehr als 100 Feuerbrand-Versuche an Apfel, Birne und anderen anfälligen Pflanzenarten dokumentiert: Gegen Triebinfektionen werden Wirkungsgrade von über 80 % erzielt. Streptomycin wird dabei in seiner Wirksamkeit deutlich übertroffen. Wichtig ist hier, dass eine Behandlung mindestens 5-10 Tage vor der Infektion erfolgt. Die Effizienz gegen Blüteninfektionen ist dagegen in der Regel geringer als die von Streptomycin. Limitierend scheint hier insbesondere eine fristgerechte Applikation zu sein. Kombinationen mit geeigneten anderen Mitteln werden gegenwärtig getestet. Bei der Wirkung von ProCa auf den Pathogenbefall dürften einerseits die induzierten morphologischen und anatomischen Effekte eine Rolle spielen. Untersuchungen innerhalb eines von der Europäischen Kommission geförderten Forschungsprojekts (QLK5-CT-1999-01583) zeigen jedoch, dass durch Effekte auf den Flavonoidstoffwechsel auch Substanzen mit Phytoalexincharakter (z.B. Luteoforol) induziert werden.

Duffy, B. Eidgenössische Forschungsanstalt für Obst-, Wein- und Gartenbau, Feuerbrand Gruppe, CH-8802 Wädenswil, Schweiz. E-mail:duffy@faw.admin.ch.

Agricultural ecosystems harbor a wide variety of microorganisms that play an integral role in plant health and crop productivity. Antagonistic and parasitic interactions have been exploited for the biological control of plant pathogens. To date, biological control has typically been viewed from the perspective of how antagonists affect pathogens. But there is another face to this interaction, how plant pathogens respond to antagonists and how this can affect the efficacy of biological control. Just as microbial antagonists utilize a diverse arsenal of mechanisms to dominate interactions with pathogens, pathogens have surprisingly diverse responses to cope with antagonism. These responses include detoxification, repression of biosynthetic genes involved in biological control, efflux of antibiotics and antibiotic resistance. This talk focuses on the self-defense mechanisms of the fungal pathogen, Fusarium oxysporum against biological control strains of Pseudomonas fluorescens. Fusarium produces the phyto-/mycotoxin, fusaric acid, which acts as a negative molecular signal repressing the promoter gene phlA in the bacterium for the essential antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol. The signal target appears to be PhlF, the putative repressor protein and probably functions by increasing the stability of the repressor complex. Interestingly this is the same way the Pseudomonas metabolic salicylic acid represses phlA suggesting the pathogen has hijacked the bacterial auto-regulation pathway to counteract antagonism. Genetic variation exists within the bacterial population, however, and many strains are insensitive to the fusaric acid-mediated repression. Evidence of possible pathogen-antagonist co-evolution are presented. Understanding pathogen self-defense mechanisms provides a novel approach to improving the durability of biologically-based disease control strategies. Stichworte: Antibiotika, biologische Bekämpfung, Fusarinsäure

Burse, A. und Ullrich, M. S.; Internationale Universität von Bremen, Campusring 1, 28759 Bremen.

Fire blight of apples and pears is promoted by particular environmental conditions such as temperature. A glucuronidase-based promoter-trapping analysis was used to study temperature-regulated gene expression in E. amylovora at 18°C and 28°C. In the course of this, the genetic locus mdeA was identified. The gene, expressed 2-fold higher at 18°C than at 28°C, encodes a multi-drug efflux protein. According to sequence comparisons the single-component efflux pump MdeA is a member of the multi-drug and toxic compound extrusion (MATE) family. The mdeA gene is widely distributed among E. amylovora and related strains. To analyse the substrate specificity of the transporter of E. amylovora, the mdeA gene was transformed into E. coli mutant KAM3 susceptible to different compounds due to the lack of the major multi-drug efflux system AcrAB. Minimal inhibition concentration tests of E. coli KAM3 complemented with the mdeA gene of E. amylovora showed substrate specificity of mdeA towards the amphiphilic cations norfloxacin, ethidium bromide, and berberine. Susceptibility tests of E. amylovora wild-type and its mdeA mutant revealed elevated sensitivity of the mutant to norfloxacin. However, in the natural environment of E. amylovora MdeA might support the defence of the plant pathogen against toxins produced by other epiphytic microorganisms. The epiphyte Pantoea agglomerans is a known antagonist of E.amylovora and produces antibiotics inhibiting growth of the pathogen. In inhibition zone assays, the mdeA mutant showed increased susceptibility to supernatants of P. agglomerans cultures as compared to the wild-type.

Laux, P.¹, Vanneste, J². und Zeller, W.¹; ¹ Institut für biologischen Pflanzenschutz der BBA, Heinrichstr. 243, 64287 Darmstadt, ² Hortresearch Ruakura, East Street, Hamilton, Neuseeland.

Mit den bakteriellen Antagonisten Pantoea agglomerans Pa21889 und Rahnella aquatilis Ra39 konnte in den Jahren 1998, 1999, 2000 und 2001 eine reproduzierbare Wirkung gegen die Feuerbrand-Blüteninfektion erzielt werden. In Versuchen zum Wirkmechanismus zeigte Pa21889 eine antibiotische Aktivität gegen Erwinia amylovora, die unabhängig von der Nährstoffzusammensetzung des Mediums auftrat. Durch Transposon Mutagenese wurde eine Mutante von Pa21889 erzeugt, die keine antibiotische Aktivität aufweist. Durch Southern-Hybridisierung konnte für diesen Stamm homologe Rekombination nachgewiesen werden. Versuche zur Populationsdaynamik auf Apfelblüten ergaben keine Unterschiede in der Kolonisierung der Blütenoberfläche in Abhängigkeit von Antibiose; dem gegenüber ist die protektive Wirkung der antibiotisch inaktiven Mutante von Pa21889 gegen die Blüteninfektion geringer als die des Wildtyps.
Im Gegensatz zu Pa21889 konnten für Ra39 keine antibiotischen Effekte gegen Erwinia amylovora nachgewiesen werden. In Wachstumsversuchen mit verschiedenen Medien wurde für diesen Stamm Nährstoffkonkurrenz als möglicher Wirkmechanismus gegen den Feuerbrand aufgezeigt. Weiterhin zeigten Infiltrationsexperimente, daß das Lipopolysaccharid von Ra39 eine Induktion des Superoxidradikals in Blättern von Apfel, Tabak und Begonie bewirkt. Dies ist ein Hinweis für eine Beteiligung der induzierten Resistenz an der protektiven Wirkung dieses Stammes gegen den Feuerbrand.
Um den bisher unzureichenden Wirkungsgrad von Ra39 zu erhöhen, wird derzeit eine Kombination mit Na-Benzoat getestet. Durch Na-Benzoat wird zusätzlich ein bakterizider Effekt auf den Feuerbranderreger bewirkt, der die indirekten Wirkmechanismen des Stammes Ra39 ergänzt.

Jock, S. und Geider, K.; Max Planck Institut für Zellbiologie, Rosenhof, 68526 Ladenburg.

Neben Stämmen von Erwinia amylovora, dem Erreger des Feuerbrands, wurden Erwinia pyrifoliae-Stämme aus Korea und einer Erwinienart aus Japan untersucht. Letztere verursachen den asiatischen Birnenbrand, der in der Symptomatik Feuerbrand sehr ähnlich ist.
Bei E. pyrifoliae fanden wir offensichtliche Veränderungen in einer Population. Von Isolaten, die zur selben Zeit aus demselben Pflanzenmaterial isoliert wurden, war etwa die Hälfte HR-negativ, d.h. sie war nicht in der Lage eine hypersensitive Reaktion an Nicht Wirtspflanzen auszulösen und war damit auch nicht mehr virulent. Durch Komplementation, Klonierung und anschließende Sequenzierung konnte eine Basenänderung im hrpL Gen nachgewiesen werden. Möglicherweise hat sich die Mutation durch den resultierenden Überlebensvorteil HR-negativer Stämme durchgesetzt.
Mittels Pulsed Field Gel Elektrophorese (PFGE) ließen sich Veränderungen im Genom nachweisen. Die Muster der E. amylovora Stämme aus Europa und dem Mittelmeergebiet waren recht einheitlich. Aufgrund geringer Bandenunterschiede lassen sich alle Stämme in vier Hauptmustertypen einteilen, deren Verbreitung nachvollzogen werden kann. Die Stämme aus Amerika zeigen dagegen sehr uneinheitliche Muster. Dies läßt den Schluß zu, dass Feuerbrand nur wenige Male von Amerika nach Europa eingebracht wurde. Trotz vieler Pflanzentransporte kommt es in Europa nicht zu einer Durchmischung der Muster.
Eine weitere Möglichkeit, Stämme molekular zu unterscheiden, ist die Analyse der Short Sequence DNA Repeats, kurz SSRs. Bei E. amylovora handelt es sich hierbei um eine Sequenz von 8 Basen auf dem Plasmid pEA29, die von 3- bis zu 15-mal wiederholt wird. Bei den japanischen Stämmen findet man auch einen Repeat, der allerdings öfter wiederholt wird: 16- bis 24-fach. Die Repeats sind von Stamm zu Stamm unterschiedlich. Für einzelne Stämme sind sie aber recht stabil, so dass sie zur Unterscheidung von Stämmen benutzt werden können.

Schollmeyer, M., Kim, W.-S., *Nimtz, M. und Geider, K.; Max- Planck- Institut für Zellbiologie, Rosenhof, D-68256 Ladenburg; *Gesellschaft für biologische Forschung, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig.

Amylovoran, das Exopolysaccharid (EPS) des Feuerbranderregers Erwinia amylovora, wurde mit dem EPS des asiatischen Birnenbranderregers Erwinia pyrifoliae verglichen. Beide Exopolysaccharide wurden durch Größenausschlusschromatographie untersucht und haben ein Molekulargewicht größer als 2.5 MDa. Um diese großen Moleküle enzymatisch in ihre Untereinheiten zu zerlegen, wurde aus dem Phagen fEa1h ein DNA Fragment mit einem Gen kloniert, das für eine EPS-Depolymerase kodiert. Das Depolymerase-Gen wurde mit einer His-tag-Markierung fusioniert, in E. coli exprimiert und die EPS-Depolymerase aus dem Zelllysat über eine Säule aufgereinigt. Das isolierte Enzym spaltete beide EPS-Typen in ihre Untereinheiten, die auch mit Elektronenspray-Massenspektrometrie (ESI-MS) untersucht wurden. Bei E. amylovora lag eine Mischung aus Pentameren und Hexameren vor, E. pyrifoliae produzierte nur Pentamere. Dieser Unterschied könnte, zusammen mit der fehlenden Levanbildung bei E.pyrifoliae, das unterschiedliche Wirtsspektrum beider Erreger erklären. Ein Vergleich der EPS-produzierenden Gene beider Erwinien auf Protein-Ebene ergab für die sechs untersuchten Genprodukte Homologien von über 90%. Inaktivierungsexperimente zeigten den Verlust der bakteriellen Virulenz beim Fehlen eines oder mehrerer EPS-produzierender Gene. EPS ist demnach ein essentieller Virulenzfaktor. Die Komplementation von inaktivierten E. pyrifoliae -EPS-Genen mit EPS-Genen aus E. amylovora war erfolgreich. Weiterhin können außer amsF alle EPS-Gene von E. amylovora mit Genen aus Erwinia (Pantoea) stewartii komplementiert werden. AmsF hat eine besondere Spezifität unter den EPS-Genen, es polymerisiert vermutlich die EPS-Untereinheiten zum hochmolekularen EPS.

Jakovljevic, V., Jock, S. and Geider, K.; Max-Planck-Institut für Zellbiologie, 68526 Ladenburg.

Fire blight is caused by the Gram-negative bacterium Erwinia amylovora and can lead to huge losses for apple and pear production. Related bacteria were isolated in Korea and Japan causing Asian pear blight on Nashi trees. The pathogens depend on the induction of the hypersensitive response (HR), measured on non-host plants, and the synthesis of an acidic exopolysaccharide for symptom formation. Both virulence factors are encoded by large gene clusters. The host range of the Asian pear pathogens is apparently restricted to European and Asian pears, whereas E. amylovora can affect more than 200 rosaceous plants. Growth of the pathogens can be diminished in the presence of other bacteria, which secrete toxic compounds or compete with colonization of the growth habitat.
Phylogenetical relationships within the genus Erwinia and related bacteria are still not fully established. In this study, we compared sequences of recA, gapDH and hrpN genes between different strains of E. amylovora, strains of two Asian pear pathogens and several other strains - including possible antagonists for E. amylovora, which were isolated in Australia from apple and pear blossoms and bark. PCR was performed with specific primers, products were cloned into appropriate plasmid vectors and sequenced. Sequence alignments were done and phylogenetical trees constructed by using various computer programs. The alignments revealed a close relatedness among two Asian pear pathogens, which caused symptoms on Nashi pears in Korea (Erwinia pyrifoliae) and in Japan. E. amylovora strains isolated from fruit trees and ornamentals and from raspberry are related among each other - but differ from the Asian pear pathogens. Sequences of non-pathogenic, levan producing epiphytic strains isolated from healthy trees in Australia and a pathogenic levan-deficient strain isolated from necrotic pear flowers in Spain, showed high degree of similarity. We conclude that the nucleotide sequences of genes recA, gapDH and hrpN can be used for differentiation of the pathogenic Erwinias and of related bacteria.

Salm, H., Kim, W.-S. und Geider, K.; Max-Planck-Institut für Zellbiologie, 68526 Ladenburg.

Das gram-negative Bakterium Erwinia amylovora verursacht bei Pflanzen aus der Familie der Rosaceen den Feuerbrand. Die Züchtung transgener Pflanzen mit einer erhöhten Resistenz gegen Erwinia amylovora bietet eine Alternative zur Anwendung von Antibiotika. Neben den bekannten Beispielen für Resistenzgene, das T4-Lysozym-Gen und die EPS-Depolymerase des Erwinia amylovora Phagen fEa1h, konnte ein weiteres potentielles Resistenzgen aus fEa1h charakterisiert werden.
Das für ein Lysozym kodierende Gen wurde mittels PCR kloniert und in einen Expressionsvektor inseriert. Neben der lytischen Aktivität des Lysozyms konnte auch eine antibakterielle detektiert werden. Diese richtet sich sowohl gegen gram-negative, als auch gegen gram-positive Bakterien. Mit verschiedenen Testsystemen konnte gezeigt werden, dass das Protein das Wachstum von E. amylovora,E. coli, E. pyrifoliae, japanischen Erwinia Stämmen, E. herbicoloa, E. stewartii und E. carotovora sowie einen gram-positiven Micrococcus luteus-Stamm hemmt. Dadurch unterscheidet sich das fEa1h-Lysozym deutlich von dem Lysozym des Bakteriophagen T4, dessen Wirkung vornehmlich gegen gram-positive Bakterien gerichtet ist. Aufgrund dieser Ergebnisse könnte der Einsatz des fEa1h-Lysozyms als Resistenzgen in Äpfeln und Birnen eine bessere Wirkung erzielen als das bisher in transgenen Pflanzen verwendete T4-Lysozym-Gen.