Arbeitskreis
Viruskrankheiten der Pflanzen

Jörg Schubert (*), Jaroslav Matousek (+), Petr Dedic (§), Frank Rabenstein*
(*) Bundesanstalt für Züchtungsforschung, Inst. f. Resistenzforschung und Pathogendiagnostik, Aschersleben; (+) Inst. f. Pflanzl. Molekularbiologie, Ceske Budejovice, Tschechische Republik; (§) Institut für Kartoffelzüchtung, Havlickov Brod, Tschechische Republik

Das NIb-Gen eines PVY-NTN-Stammes wurde über RT-PCR kloniert. Es weist im N-terminalen Bereich eine Deletion (2 Aminosäuren, AA), im zentralen Bereich eine kurze +1/-1-Frameshift (14 AA) und im C-terminalen Bereich eine Deletion von 400 nt auf. Es wurde, z. T. mit mit dem enhanced blue fluorescing protein (EBFP) fusioniert, unter Kontrolle des 35-S-Promotors gleichzeitig mit einem Gus-i-Gen über Agrobakterium-vermittelten Gentransfer ins Kartoffelgenom übertragen. Insgesamt konnten für das NIb 181 und für das NIb-EBFP 111 unabhängige Transformanten auf Resistenz gegen einen NTN-Stamm des PVY getestet werden. Von Klonen, bei denen laut DAS-ELISA alle Pflanzen völlig befallsfrei geblieben waren, wurde eine Augenstecklingsprüfung durchgeführt. Unter den nur mit dem NIb transformierten Klonen konnten keine hochresistenten identifiziert werden. Die NIb-EBFP-Variante ergab 6 resistente Klone, von denen 3 auch in der sich anschließenden Augenstecklingsprüfung keinerlei Befall zeigten. Die Versuche wurden mehrfach wiederholt. 5 der Klone wiesen Resistenz vom Recovery-Typ auf, einer war immun. Der immune Klon war auch resistent gegen PVA und PVV. Es bestand keine Korrelation zwischen Gus-Aktivität und Resistenz. Die Überprüfung der EB-Fluoreszenz ergab, dass nicht alle Pflanzen eines Klons diese aufwiesen. Das legt die Vermutung nahe, dass die Ausprägung der Resistenz nicht auf Proteinniveau erfolgt. Es konnte auch keine Korrelation zwischen der Anzahl der Genkopien und der Resistenz aufgefunden werden. So wies die immune Variante 3 , während weniger resistente bis zu 10 Genkopien aufwiesen. Auch im Expressionsniveau ließen sich mit Northern-Analysen keine wesentlichen Unterschiede zwischen anfälligen und resistenten Klonen feststellen. Der Mechanismus der Resistenzinduktion bleibt somit unklar. Die Vermutung liegt nahe, dass das EBFP zu einem Targeting der RNA oder des Proteins führt und dadurch die Ausprägung der Resistenz ermöglicht oder aber die RNA stabilisiert.

Nutzung unspezifischer Resistenz gegenüber dem Turnip mosaic virus (TuMV) in Kopfkohl (Brassica oleracea)

R. Krämer, F. Marthe, U. Ryschka, E. Klocke, E. Clauss, G. Schumann
Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, Institut für gartenbauliche Kulturen, Neuer Weg 22/23, D-06484 Quedlinburg

Das Turnip mosaic virus (TuMV) kann im Weisskohl (Brassica oleracea var. capitata L.) bis zu 25 % Ertragsausfall verursachen. Daneben können insbesondere während der Kühllagerung des Ernte-gutes Nekrosen auftreten, die zu erheblichen Qualitätseinbussen führen. Hieraus resultiert die Auf-gabe zur Verbesserung der TuMV-Resistenz von Kopfkohl. Bei der Pathotypisierung von TuMV-Isolaten werden in Abhängigkeit vom Differentialsortiment zwischen 4 und 12 Pathotypen unterschieden. Die Pathotypisierung eigener TuMV-Isolate an Raps-linien und die Ergänzung des für den europäischen Raum relevanten TuMV-Pathotypenspektrums erfolgte in Zusammenarbeit mit J. Walsh und C. Jenner vom Horticultural Research Institute Wellesbourne (Großbritannien). In den Resistenzprüfungen (mechanische Inokulation) wurden unter Gewächshaus- und Frei-landbedingungen bis zu 8 TuMV-Isolate, die 6 Pathotypen repräsentieren, als Einzelisolate und in 2 Isolatgemischen (Mix 1, 2) eingesetzt. In 2 B. oleracea-Primitivformen und in 3 Raphanus sativus-Herkünften (Radies, Rettich) konnte weitgehend TuMV-Pathotypen unspezifische Resistenz evaluiert werden. Diese Pflanzen zeigten keine Symptome und waren im DAS-ELISA negativ. Die Übertragung der TuMV-Resistenz aus den Brassica oleracea-Primitivformen in Kopfkohl erfolgt durch konventionelle Kreuzung kombiniert mit sukzessiver Resistenzselektion. Die TuMV-Resistenz aus den Raphanus-Herkünften soll durch Protoplastenfusion in B. oleracea übertragen werden. Aus den somatischen Raphanobrassica-Hybriden wurden bisher einzelne Klone selektiert, die Resistenzen gegen nahezu alle getesteten Einzelisolate und Mix 1 (3 Pathotypen) sowie Mix 2 (6 Pathotypen) aufwiesen. Insgesamt zeigte sich, das der Einsatz von Isolatgemischen nicht gleichzeitig auch eine Erhöhung der Virulenz zur Folge hatte. Es traten in Abhängigkeit vom getesteten Pflanzenmaterial offensichtlich sowohl antagonistische als auch synergistische Effekte zwischen den einzelnen TuMV-Isolaten auf.

K. Graichen (*), F. Rabenstein (+) und E. Schliephake(*)
Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, (*) Institut für Epidemiologie und Resistenz, (+) Institut für Resistenzforschung und Pathogendiagnostik, Theodor-Roemer-Weg 4, D-06449 Aschersleben,

Für Resistenzprüfungen stehen in der BAZ in Aschersleben 30 Isolate des Turnip yellows virus (TuYV) aus verschieden Regionen Europas sowie 7 Isolate aus Afrika, Asien und Australien zur Verfügung. Um Informationen zur Virulenz der TuYV-Isolate zu erhalten wurden je 24 Pflanzen der Sommerrapssorte "Callypso" mit 20 ausgewählten Isolate durch Blattlausübertragungen inokuliert und im insektensicheren Gazehaus kultiviert. 10 Wochen p.i. wurde für alle Einzelpflanzen serologisch der Infektionserfolg unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums und eines spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAk G4C10) getestet. Ende Juli erfolgte eine Längenmessung der Einzelpflanzen und die Bestimmung des Kornertrages je Pflanze. Alle geprüften Isolate waren in der Lage, die Testsorte zu infizieren und bewirkten deutliche Reaktionen im serologischen Nachweis mit dem polyklonalen Antiserum. Die Reaktion mit den mAk G4C10 weist auf wenigstens zwei Serotypen hin. Durch alle Isolate wurden signifikant Längenwachstum und Kornertrag der Einzelpflanzen im Vergleich zu nichtinfizierten Kontrollpflanzen verringert. Gleichzeitig ließen sich graduelle Unterschiede in der Wirkung der einzelnen Isolate auf Längenwachstum und Ertrag feststellen. Den stärksten Einfluss auf den Kornertrag zeigten die Isolate VF 120, BN 5 ASL und Prag 1. Eine Prüfung der TuYV-Isolate mit fünf mAk im TAS-ELISA ergab eine Gruppierung in Serotypen nur mit mAk G4C10, während die übrigen mAk 2G5, 4D3, 6A12 und 6F2 keine Differenzierung ermöglichten. Es konnte jedoch keine eindeutige Korrelation zwischen dem Einfluss der Isolate auf den Kornertrag und der relativen Viruskonzentration, d. h. Stärke der Reaktion im polyklonalen DAS-ELISA bzw. mit mAk im TAS-ELISA, festgestellt werden.

R. Koenig und D.-E. Lesemann
Biologische Bundesanstalt, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11/12, 38104 Braunschweig

In den vergangenen Jahren haben wir von Zierpflanzenbetrieben wiederholt Einsendungen von Diascia-Hybriden oder Sorten von Nemesia fruticans (beides Scrophulariaceae) erhalten, die typische Virussymptome zeigten und in denen sich elektronenmikroskopisch isometrische Viruspartikeln mit charakteristischer Tymovirus-Morphologie nachweisen ließen. Immun-elektronenmikroskopisch und im Agargel-Doppeldiffusionstest reagierten diese Viren in der Tat sehr stark mit Antiseren gegen Tymoviren aus dem Verwandtschaftskreis des Scrophularia mottle virus (ScrMV), Ononis yellow mosaic virus (OYMV), Anagyris yellow mosaic virus (AYMV) und Plantago mottle virus (PlMV). Die durch das OYMV, AYMV und PlMV im Agargel-Doppeldiffusionstest mit ihren homologen Seren gebildeten Präzipitationslinien bildeten deutliche Sporne über die mit dem Nemesia- oder Diascia-Virus gebildeten Präzipitationslinien. Mit ScrMV wurde allerdings nur ein ganz schwacher Sporn beobachtet, und das auch meist erst nach mehreren Tagen. Auf Grund dieses Befundes hätten wir das Nemesia- bzw. Diascea-Virus als einen sehr nahe verwandten Stamm des ScrMV eingestuft. Auch im DAS-ELISA waren diese Viren problemlos mit Antiseren gegen das ScrMV nachzuweisen. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die Hüllproteine und für die C-terminalen Bereiche der Replikase ergaben allerdings nur 72% bzw. 51% Sequenzidentität für das Nemesia-Virus bzw. das nach den Sequenz-Daten identische Diascia-Virus auf der einen Seite und das ScrMV auf der anderen. Nach den "Guidelines to the demarcation of virus species" (van Regenmortel et al., Archives of Virology 142, 1505, 1997) muß das neue Diascia- bzw. Nemesia-Virus als eigene Spezies angesehen werden.

D.-E. Lesemann (1) , J. Dalchow (2), S. Winter (3) und E. Pfeilstetter (4)
(1) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11/12, D-38104 Braunschweig, (2) Am Ziegelesch 4, D-72488 Sigmaringen, (3) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Messeweg 11/12, D-38104 Braunschweig, Abteilung für Nationale und Internationale Angelegenheiten der Pflanzengesundheit, Messeweg 11/12, D-38104 Braunschweig.

Im Frühjahr 1999 wurden in den Niederlanden, sowie in zwei Fällen in Großbritannien in Tomatenkulturen Infektionen mit einem Virus festgestellt, die sich in den befallenen Beständen sehr schnell ausbreiteten. Während diese Fälle mit Blattsymptomen einher gingen, entstanden in einem Betrieb in Hessen beim Befall mit dem gleichen Virus nur Fruchtsymptome.Untersuchungen zeigten, daß ein Virus der Gattung Potexvirus vorlag, welches aus Tomatenkulturen bisher nicht bekannt war. Immunelektronenmikroskopie mit dem in der BBA vorhandenen Antiserumpanel für Potexviren und mit dem in der BBA-Antigenbank vorhandenen Typisolat identifizierte die holländischen, englischen und deutschen Tomaten-Isolate serologisch einheitlich als das 1980 aus Peru beschriebene Pepino mosaic virus. Die ursprüngliche Wirtspflanze des Virus war Solanum muricatum (Pepino) und die Infektion war seinerzeit nur aus einer sehr kleinen und isolierten Region in Peru bekannt. Das Virus war in der Zwischenzeit nicht mehr aufgefunden worden. Weitere in England und den Niederlanden durchgeführte begrenzte Vergleiche der Nukleinsäuresequenzen bestätigten die serologische Identifizierung, wiesen aber zusätzlich nach, daß möglicherweise ein vom Typstamm abweichender Tomatenstamm vorliegt. Das plötzliche und verbreitete Auftreten des PepMV in europäischen Tomatenkulturen wirft eine Reihe von dringenden Fragen hinsichtlich des Ursprungs, der Ausbreitungswege, der Ausbreitungseffektivität, des Wirtskreises und des Infektionsrisikos für andere Solanaceenkulturen (einschließlich Kartoffel) auf.

J. Bendiek, U. Ehlers
Robert Koch-Institut, Zentrum Gentechnologie, Wollankstrasse 15-17, 13187 Berlin

Freisetzungen gentechnisch veränderter Organismen (GVO) unterliegen den Regelungen des Gentechnikrechts. An der Umsetzung wesentlicher Bereiche dieser Regelungen ist das Robert Koch-Institut (RKI) direkt als Genehmigungsbehörde für Anträge auf Freisetzung und Inverkehrbringen gentechnisch veränderter Organismen und indirekt als Geschäftsstelle der Zentralen Kommission für die Biologische Sicherheit (ZKBS) beteiligt. Der Vortrag gibt eine aktuelle Übersicht über die Bedeutung von Freisetzungen gentechnisch veränderter Pflanzen mit gentechnisch vermittelter Virusresistenz in Deutschland und der Europäischen Union, aufgeschlüsselt nach Pflanzenarten und Virusspezies. Soweit möglich, werden die verschiedenen verfolgten Strategien zur Erzeugung der Virusresistenz benannt. Eine kurze Beschreibung des Genehmigungsverfahrens bei Freisetzungen in Deutschland vervollständigen den Vortrag.

J. Schiemann
Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11/12, 38104 Braunschweig

In Deutschland werden gegenwärtig Zielstellungen, Kriterien und Methoden des anbaubegleitenden Monitoring gentechnisch veränderter Pflanzen auf der Grundlage bereits vorhandener Aktivitäten und Netzwerke erarbeitet. Die Notwendigkeit hierfür ergab sich aus der Koalitionsvereinbarung der Bundesregierung, in der der Frage der wissenschaftlichen Begleitung des großflächigen Anbaus transgener Pflanzen große Bedeutung beigemessen wird, und aus der gegenwärtig erfolgenden Novellierung der Gentechnik-Richtlinie 90/220/EWG, die ein anbaubegleitendes Monitoring gentechnisch veränderter Pflanzen vorschreiben wird. Auf der 72. Arbeitssitzung des Deutschen Pflanzenschutzdienstes wurde die Gründung der Arbeitsgruppe "Anbaubegleitendes Monitoring gentechnisch veränderter Pflanzen im Agrarökosystem" unter Federführung der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) beschlossen, die im April 1999 erfolgte. Der Arbeitsgruppe gehören Vertreter des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten (BML), verschiedener BBA-Institute, mehrerer Pflanzenschutzämter, des Robert Koch-Instituts (RKI), des Umweltbundesamtes (UBA), des Bundessortenamtes (BSA), der Sortenüber-wachung und Sortenberatung der Länder, des Bundesverbandes Deutscher Pflanzenzüchter (BDP), des Instituts für Zuckerrübenforschung (IfZ), der universitären Forschung sowie der Europäischen Akademie für Umwelt und Wirtschaft an. Gegenwärtig wird in der AG die Erfassung von Auswirkungen auf das Agrarökosystem diskutiert. Der Beitrag soll zu einer Diskussion über Monitoring-Kriterien für transgene virusresistente Pflanzen anregen.

E. Maiss, M. Varrelmann und R. Götz
Institut für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, Universität Hannover, Herrenhäuser Str. 2, 30419 Hannover

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Kulturpflanzen mit unterschiedlichen Virusgenen transformiert. Ziel der Herstellung dieser transgenen Pflanzen ist die Erhöhung der Virusresistenz. In den USA befinden sich bereits einige transgene virusresistente Pflanzen in der Vermarktung. Obwohl transgene Pflanzen einen positiven agronomischen Aspekt besitzen, müssen aber auch potentiell negative Auswirkungen ihres Anbaus berücksichtigt werden. Es sollen deshalb Risikoszenarien transgener virusresistenter Pflanzen - wie etwa Heterologe Enkapsidierung, Rekombination und Synergismus - erläutert und mögliche Wege für eine Risikominimierung aufgezeigt werden.

Sohn, Anke, Schulze Sabine und Steinbiß, Hans-Henning
Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Carl-von-Linné-Weg 10, 52829 Köln

Gelbverzwergungsviren (BYDVs) stellen eine weltweit verbreitete Gruppe der ökonomisch relevanten Pflanzenviren dar. Jedes Jahr verursacht BYDV-Befall dramatische Ernteverluste hauptsächlich bei Gerste; Hafer und Weizen. Den phloemlimitierten Viren dienen spezifische Blattlausarten als Vektoren zur Verbreitung. Wiederholte Insektizidspritzungen gegen Blattläuse stellen zur Zeit die einzige wirkungsvolle Bekämpfungsstrategie dar. Da keine wirksamen natürliche Resistenzen gegen BYDV in den wirtschaftlich bedeutenden Getreiden bekannt sind, stellt die Erzeugung transgener Pflanzen eine sinnvolle Maßnahme zur Virusbekämpfung dar. Ziel der Arbeit ist es, Gerste mit Konstrukten zu transformieren, die Virussequenzen entsprechende Sequenzen enthalten und hierdurch eine sogenannte Pathogen-vermittelte Resistenz einzuführen. Neben Strategien, die auf einem proteinabhängigen Mechanismus beruhen, sind auch solche, die auf einem RNA-abhängigen Mechanismus basieren, erfolgreich angewandt worden. Die Erzeugung dieser auf RNA basierenden Resistenz beinhaltet den Vorteil, daß die Pflanze kein Fremdprotein erzeugt. Deshalb wurde Gerste mit einem Plasmid transformiert, das BYDV-PAV entsprechende Sequenzen in untranslatierbarer Form enthält. Dieses Konstrukt wurde zusammen mit einem Plasmid, welches das bar-Gen als Selektionsmarker enthält, mittels Partikelbeschuss auf Scutella unreifer Embryonen der Gerstensorte Golden Promise übertragen. Aus diesem Gewebe wurde Kallus erzeugt, der auf Bialaphos-haltigem Medium selektioniert wurde. Aus den transgenen Kalluslinien wurden Pflanzen regeneriert. PCR und Southern-Analyse zeigen, daß beide Plasmidkonstrukte übertragen wurden. Die nach "embryo rescue" erzeugte T1-Generation spaltet nach Mendel auf. Die transgenen Pflanzen sind fertil und phänotypisch normal. Untersuchungen auf Virusresistenz werden zur Zeit durchgeführt.

J. Mörbel (1), U. Jäger (1), T. Wetzel (1), A. Feldhoff (2) und G. Krczal (1)
(1) Staatliche Lehr- und Forschungsanstalt, Zentrum Grüne Gentechnik, 67435 Neustadt,(2) InnovaPlant GmbH & Co. KG, 55454 Gensingen

Nach der Etablierung eines Transformations- und Regenerationsprotokolls für Osteospermum ecklonis mit Hilfe von Reportergenen konnten Transformationen mit LMV (Lettuce Mosaic Potyvirus)-abgeleiteten Konstrukten durchgeführt werden. Zwei Konstrukte wurden verwendet, die entweder eine mutierte cDNA des Gens der NIa Protease (VPg und Pro) mit zerstörter Proteinase-Schnittstelle oder ein Fragment der CP-cDNA enthielten. Es wurde sowohl Osteospermum ecklonis als auch Nicotiana benthamiana transformiert. Mit einer einfachen, schnell durchzuführenden Methode wurde Gesamt-DNA aus regenerierten Pflanzen extrahiert. Qualität und Quantität der aus beiden Pflanzenarten extrahierten DNA war für PCR-Nachweise ausreichend. Mit konstruktspezifischen Primern konnte das Transgen in regenerierten Pflanzen detektiert werden. Parallel dazu wurde mit Primern, die ein Fragment des für Agrobakterien typischen chvE-Gens amplifizieren, ein PCR-Test durchgeführt um die Regenerate auf Kontamination mit Agrobacterium tumefaciens zu überprüfen. Für N. benthamiana wurde zusätzlich eine PCR durchgeführt, bei der die Amplifikation eines internen Standards sicherstellt, daß Qualität und Quantität der eingesetzten DNA ausreichend sind. Auf diese Weise können falsch-negative PCR-Ergebnisse ausgeschlossen werden.

Jeremy Thompson(*) and Fernando García-Arenal.
Patología Vegetal, Depto de Biotecnología, ETSI Agronomos, Universidad Politécnica de Madrid, Avda Complutense s/n, Madrid 28040, Spain, (*)present address: Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenschutz im Obstbau, Schwabenheimer Str. 101, 69221 Dossenhei

The movement of the majority of plant viruses in their host can be described as having two main steps; 1) Cell-to-cell movement, from the inoculated cells to the vasculature, and, 2) Long-distance or systemic movement through the phloem, which results in the systemic infection of the susceptible host. Of these two processes the former is more understood. However the latter, in terms of how a virus enters and exits the vasculature, and how it is transported through the plant is less defined. The aim of this work was, by immunomicroscopy (light and electron), to shed light on these questions. A pseudorecombinant of cucumber mosaic cucumovirus (CMV), produced from transcripts of cDNA clones, containing the coat protein (CP) and movement protein (MP) of tomato aspermy cucumovirus (TAV), was shown to be defective for long distance movement in cucumber (Cucumis sativus L.) The cellular location of this pseudorecombinant was compared with that of CMV, which systemically infects cucumber, in inoculated cotyledon. It was seen that, in contrast to the pseudorecombinant, entry of CMV into both minor and major veins resulted in the infection of the vascular parenchyma and companion cells. This observation implicates the bundle sheath/phloem interface as the cellular barrier to systemic infection (Thompson and García-Arenal, 1998). In another set of experiments the progress of infection was analysed by examining inoculated cotyledons, internodes and leaves of cucumbers infected with cucumber green mottle mosaic tobamovirus (CGMMV) at various days post-inoculation. From these results an overall picture of how the virus is loaded, transported and unloaded in the plant during infection was obtained.
J. Thompson and F. García-Arenal (1998) MPMI. 11(2): 109-114.

W. Benthack (1), N. Mielke (1), C. Büttner(2), H.-P. Mühlbach (1)
(1) Universität Hamburg, Inst. für Allgemeine Botanik, Ohnhorststr. 18, D-22609 Hamburg. (2) Humboldt-Univeristät, Inst. für Gartenbauwiss., Lentzeallee 55-57, D-14195 Berlin

Chlorotische Ringflecke und Blattscheckungen sind weit verbreitete Symptome an erkrankten Ebereschen. Das putative Agens ist pfropfungsübertragbar, eine mechanische Übertragung konnte bis heute aber nicht erzielt werden. Auch war es bisher nicht möglich, Viruspartikel zu isolieren oder im Elektronenmikroskop darzustellen. In Blattproben und Rindenproben konnte Doppelstrang RNA (dsRNA) nachgewiesen werden, wobei sich die dsRNA-Muster in beiden Geweben unterschieden. Das dsRNA-Muster in Blattproben wies zudem jahreszeitlich bedingte Schwankungen auf, die in Rindenproben nicht beobachtet werden konnten. Ein Nachweis von dsRNA in symptomlosen Ebereschen war in keinem Fall möglich. Der Nachweis von dsRNA und die charakteristischen Symptome lassen auf eine Virusinfektion der Eberesche schließen. Mit Hilfe einer ECL-markierten dsRNA-Sonde aus Blattproben konnte das Blatt-spezifische dsRNA-Muster in Blattproben, Blattknospen und Blütenknospen nachgewiesen werden. Eine ECL-markierte Rinden-spezifische dsRNA Sonde detektierte das gleiche Blatt-spezifische dsRNA-Muster in Rinden-, Blatt-, Blattknospen und Blütenknospenproben! Ausgehend von dsRNA aus Blattproben konnte mit Random-Primern und DOP-PCR cDNA synthetisiert werden, die durch TA-Cloning kloniert wurde.Aus den cDNA-Klonen wurden Dig-markierte RNA Sonden synthetisiert und in Northern-Hybrdisierung gegen dsRNA und Gesamt-RNA aus erkrankten und symptomlosen Ebereschen eingesetzt. Außerdem wurden dsRNA-spezifische Primer von einigen cDNA-Klonen abgeleitet. Ziel der weiteren Arbeiten ist die Charakterisierung des oder der putativen Viren in erkankten Ebereschen.

D. Galetzka (1), M. Russo (2), L. Rubino (2) und G. Krczal (1)
(1) Staatliche Lehr- und Forschungsanstalt, Zentrum Grüne Gentechnik, 67435 Neustadt
(2) Centro di Studio sui Virus e le Virosi delle Colture Mediterranee, 70126 Bari, Italien

1989 und in darauffolgenden Jahren wurde in verschiedenen Regionen Rheinhessens eine Viruserkrankung an Statice (Goniolimon tataricum) beobachtet. Symptome waren Blattdeformationen, Mosaikbildung und Blattnekrosen, die zu einem stark reduzierten Ertrag der Felder führten. Als Verursacher konnte ein isometrisches Virus isoliert werden, das serologisch eng mit Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) verwandt ist. Die genomische cDNA wurde kloniert und sequenziert. Die Sequenzanalyse zeigte eine für Tombusviren typische Genomorganisation und das von der Nukleotidsequenz abgeleitete Coat-Protein zeigte hohe Ähnlichkeit mit dem von TBSV-BS3. Um die biologischen Eigenschaften des Virus weiter zu charakterisieren, wurde ein infektiöser full-length Klon des von uns isolierten Virus (TBSV-Sta) hergestellt. Da das Virus bodenübertragbar ist, ist eine Bekämpfung von Vektoren nicht möglich. Die Herstellung transgener, virusresistenter Pflanzen ist die einzige Möglichkeit, in Zukunft Anbau auf viruskontaminierten Flächen zu betreiben. Für die Transformationskonstrukte wurde die cDNA des Replikasegens aus dem infektiösen full-length Klon von TBSV-Sta verwendet, in Anlehnung an bereits für andere Tombusviren beschriebene Strategien zur Herstellung virusresistenter Pflanzen. Zur Zeit werden noch Transformationsexperimente mit GUS als Reportergen durchgeführt, um ein Transformations- und Regenerationsprotokoll zu etablieren.

(1) Institut für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, Universität Hannover, Herrenhäuser Straße 2, D-30419 Hannover, (2)Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11-12, D-38104 Braunschweig

Das Spartina mottle virus (SpMV) wurde erstmals 1980 in Großbritannien als Krankheitserreger des Schlickgrases, Spartina spp., entdeckt. Das Virus wurde inzwischen auch an der deutschen Nordseeküste nachgewiesen. Stellenweise, wie bei Nesmersiel und auf Baltrum, sind die Spartina-Rasen vollständig mit Virus infiziert. Aufgrund seiner morphologischen Eigenschaften (Partikelmorphologie, Bildung von zylindrischen Einschlußkörpern) wurde das SpMV den Potyviriden zugeordnet. Nach bisherigen Untersuchungen besteht keine serologische Verwandtschaft von SpMV zu anderen Potyviriden. Die taxonomische Einstufung von Potyviriden erfolgt zunehmend anhand molekularbiologischer Daten. Die Hüllprotein-Sequenz von SpMV wurde bestimmt und mit Hüllprotein-Sequenzen von Viren aus den verschiedenen Genera der Potyviridae verglichen. Zwischen den Sequenzen des Hüllproteins von SpMV und den milbenübertragbaren Viren AgMV, HoMV, und RGMV (Rymoviren) besteht eine Übereinstimmung von ca. 30%, zu den ebenfalls milbenübertragbaren BrSMV und WSMV (Tritimoviren) aber nur eine von ca. 20%. Nur eine geringe Übereinstimmung (ca. 20%) zeigt SpMV zu den Bymoviren, den Ipomoviren und den Macluraviren. Demgegenüber ist diese mit ca. 30% zu blattlausübertragbaren Potyviren (z.B. CSV, MDMV, PVY) größer. SpMV wurde gegen verschiedene Antiseren im ELISA und mit elektronenmikroskopischen Methoden getestet. Es wurde jedoch keine serologische Verwandtschaft zwischen SpMV und verschiedenen Potyviriden nachgewiesen. Eine nach englischen Untersuchungen schwache serologische Reaktion des SpMV mit einem Antiserum gegenüber AgMV wurde in eigenen Versuchen nicht bestätigt. Eine Einstufung von SpMV in das Genus Rymovirus, wie aus Ergebnissen englischer Untersuchungen gefolgert wurde, wird weder von den molekularbiologischen noch von den serologischen Daten eindeutig bestätigt.

T. Timchenko(1), L. Katul, Y. Sano(2), F. de Kouchkovsky(1), B. Gronenborn(1) & H. J. Vetten
Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und Biologische Sicherheit, D-38104 Braunschweig, Germany;
(1) Institut des Sciences Végétales, CNRS, 91198 Gif sur Yvette, France;
(2) Kyoto Institute of Technology, Matsugasaki, Sakyo-ku, Kyoto 606-8585, Japan

Faba bean necrotic yellows virus (FBNYV), Milk vetch dwarf virus (MDV) and Subterranean clover stunt virus (SCSV) sind Nanoviren, die als Krankheitserreger an Körner- und Futterleguminosen in unterschiedlichen geographischen Regionen Bedeutung erlangt haben. In Analogie zu unseren jüngsten Untersuchungsergebnissen am FBNYV konnten wir sowohl in MDV- als auch SCSV-infizierten Gewebe erstmals eine virale DNA identifizieren, die ein sogenanntes Master-Rep-Protein enkodiert, das für die Replikation des multiplen zirkulären ssDNA-Genoms eines Nanovirus unentbehrlich zu sein scheint. Die Master-Rep-Proteine des MDV und SCSV weisen eine auffällige Ähnlichkeit in Sequenz und Funktion mit dem Master-Rep-Protein des FBNYV auf. Alle drei Proteine sind auch mit dem vermuteten Master-Rep-Protein des Banana bunchy top virus phylogenetisch eng verwandt. Wie für FBNYV schon gezeigt, sind auch die Master-Rep-Proteine des MDV und SCSV zur Initiation der Replikation einer homologen DNA (z.B. die, welche das Kapsidprotein des betreffenden Virus enkodiert) befähigt. Die Verwendung von heterologen Kombinationen zweier DNA-Komponenten in Replikationsexperimenten zeigte, daß die Master-Rep-Proteine des FBNYV, MDV und SCSV auch die Replikation einer heterologen Nanovirus-DNA initiieren können. Diese Ergebnisse haben vermutlich nicht nur Konsequenzen für die Nanovirustaxonomie, sondern sie deuten vielleicht auch darauf, daß ein "genetic reassortment" bei Nanoviren unter natürlichen Bedingungen stattfinden und zu deren Evolution erheblich beigetragen haben könnte.

Turturo, C.(1), Rott, M.E.(1), Minafra, A.(2), Saldarelli, P.(2), Martelli, G.P.(2) und Jelkmann, W.(1)
(1) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenschutz im Obstbau, Schwabenheimer Str. 101, 69221 Dossenheim, (2) CNR Centro Virus e Virosi delle Colture Mediterranee, Dipartimento di Protezione delle Piante dalle Malattie, Universita' di Bari, Via Amendola 165/A, 70126 Bari, Italy

Die Blattrollkrankheit der Rebe ist eine wirtschaftlich bedeutsame Virose. Sie wird durch Closteroviren verursacht. Mittlerweile sind sieben serologisch unterscheidbare Closteroviren, GLRaV-1 bis -7, in Verbindung mit der Krankheit beschrieben worden. Von diesen Viren wurde das nahezu vollständige Genom der Typen 1 bis 3 charakterisiert. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand sind in Deutschland die Typen GLRaV-1 und -3 vorherrschend. Im Rahmen von weiteren Charakterisierungsarbeiten wurden dsRNAs eines GLRaV-7 Isolates isoliert. Mit Hilfe der DOP-PCR sowie einer Technik, geeignet zur Klonierung von cDNA nach Synthese aus geringen dsRNA Mengen, wurden insgesamt 23 virusspezifische cDNA-Klone isoliert und in Teilen sequenziert. In Datenbankanalysen konnten Sequenzhomologien mit weiteren Closteroviren ermittelt werden. Hierzu gehören LChV, LIYV, GLRaV-1 bis -3 und BYV. Homologien wurden u.a. in konservierten Abschnitten der Methyltransferase und Helicase sowie zu den Hüllproteingenen gefunden. Basierend auf der Sequenz eines cDNA-Klones aus der DOP-PCR wurden Primer zur Vermehrung eines 189 bp Fragmentes entwickelt. In PCR-Tests wurden 25 verschiedene Isolate aus Albanien, Griechenland, Ungarn, Ägypten und Italien untersucht. Obleich alle Isolate im ELISA mit einem GLRaV-7 Antiserum reagierten, wurden nicht alle Isolate in der PCR nachgewiesen.

W. Deppert und H.-H. Kassemeyer
Staatliches Weinbauinstitut Freiburg, Merzhauserstr. 119, 79100 Freiburg

Die hier vorgestellten Experimente beruhen auf der Überlegung, daß der Gehalt an Viren in Pflanzen durch die Umwelt beinflußbar ist. Für alle Untersuchungen wurden Pflanzen (Vitis vinifera, cv. Blauer Spätburgunder) verwendet, die mit Grapevine leafroll associated virus-3 (GLRaV-3) infiziert waren. Kontrollpflanzen waren GLRaV-3-frei. Zu verschiedenen Zeiten wurden Blattproben entnommen und im ELISA auf Virus getestet, wobei in Abhängigkeit vom Wachstum alte und junge Blätter getrennt aufgearbeitet wurden. In einem ersten Experiment wurden Topfpflanzen unter einem Glasdach angezogen und unterschiedlichen Gießregimes ausgesetzt, um Trockenstreß zu simulieren. Dieser Versuch fand zwischen Juni und September 1999 statt, wobei jede Woche Proben genommen wurden. Ein weiterer Versuch wurde ebenfalls mit Topfpflanzen durchgeführt, jedoch wurden diese in Klimaschränke gestellt, um die Umgebungstemperatur variabel gestalten zu können. Ansonsten wurden die Pflanzen optimal mit Wasser versorgt und in einem Licht Dunkel-Wechsel (LD 13:11) gehalten. Alle 2 Wochen wurden Blattproben auf Virus untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden gezeigt und zur Diskussion gestellt.

M. Maixner, W. Reinert und H. Darimont
Biologische Bundesanstalt, Institut für Pflanzenschutz im Weinbau, Brüningstraße 84, 54470 Bernkastel-Kues

Neben der weitverbreiteten Vergilbungs- oder Schwarzholzkrankheit, einer Phytoplasmose vom Stolbur-Typ, tritt in Deutschland eine weitere Rebphytoplasmose auf, die wegen ihres Verbreitungsschwerpunkts als FD-Pfalz bezeichnet wird. Wie der Erreger der Flavescence dorée (FD) gehört das FD-Pfalz-Phytoplasma in die Elm Yellows-Gruppe. Beide Pathogene lassen sich auf dem Niveau der 16S-rDNA nicht unterscheiden, RFLP-Analysen nicht-ribosomaler DNA-Fragmente ermöglichen jedoch die Differenzierung der beiden Erreger, wobei von der FD-Pfalz drei RFLP-Typen unterschieden werden können. Der Vektor der FD war in Transmissionsversuchen nicht in der Lage, die FD-Pfalz zu übertragen. Alle drei RFLP-Typen des FD-Pfalz Phytoplasmas wurden sowohl in Erlen, die sehr häufig von diesem Pathogen infiziert sind, als auch in Reben und der Zikade Oncopsis alni gefunden. Nachdem diese Zikade schon als Vektor des Phytoplasmas in Erlen identifiziert worden war, konnten nun auch Reben experimentell durch O. alni inokuliert werden. Sowohl die Infektionshäufigkeit in den Zikadenpopulationen als auch die Übertragungseffizienz des Vektors auf Reben sind gering. Im Gegensatz zur Schwarzholzkrankheit, die aufgrund der klimatischen Ansprüche ihres Vektors vor allem in qualitativ hochwertigen Steillagen Schäden verursacht, tritt die FD-Pfalz sowohl in der Pfalz als auch in Rheinhessen und an der Mosel vornehmlich in Flachlagen in der Nähe von Erlenbeständen auf. Sollte sich O. alni als der einzige Vektor der FD-Pfalz erweisen, ist nicht mit epidemischen Ausbrüchen der Krankheit zu rechnen, wie sie von der FD bekannt sind.

Rott, M.E. und Jelkmann, W.
Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenschutz im Obstbau, Schwabenheimer Str. 101, 69221 Dossenheim

An Süßkirschen ist eine große Zahl verschiedener Virosen beschrieben. Hierzu gehören Blattscheckungen und Rostfleckungen, wie cherry mottle leaf (CML), cherry green ring mottle (CGRM), cherry rusty mottle (European) (CRM-E), cherry rusty mottle (American) (CRM-A) cherry necrotic rusty mottle (CNRM) und cherry necrotic mottling leaf (CNM). Im Zusammenhang mit diesen Erkrankungen wurden erst vor kurzem das CMLV (American), ein Vertreter der Trichoviren und das CGRMV, welches vorläufig den Foveaviren zugeordnet wurde, eingehend charakterisiert. Mit Hilfe der DOP-PCR wurden aus dsRNA, isoliert aus CNRM befallenen Pflanzen, cDNA-Klone erstellt und sequenziert. Datenbankrecherchen wiesen unterschiedliche Grade von Homologien zu CGRMV auf. Basierend auf weiteren Klonierungs- und PCR-Arbeiten konnten dem CGRMV nahe verwandte Viren im Zusammenhang mit europäischen Isolaten von CML, CRM, CNRM und CNM nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde ein bisher nicht bekanntes und vermutlich in Kirschen weit verbreitetes latentes Virus, cherry virus B (CVB), identifiziert.

E. Schliephake, A. Habekuß
Bundesanstalt für Züchtungsforschung, Institut für Epidemiologie und Resistenz, Theodor-Roemer-Weg 4, 06449 Aschersleben

In Untersuchungen zur Übertragung des Gerstengelbverzwergungsvirus (BYDV-PAV) auf verschiedene Hordeum bulbosum Klone erwies sich ein Klon als nicht infizierbar. Voraussetzung für eine Infektion der Gerste durch das BYDV-Luteovirus ist das Zusammentreffen von anfälliger Wirtspflanze mit einem infektiösen Blattlausvektor und die erfolgreiche Übertragung. Eine erfolglose Virusübertragung mit einem potentiellen Blattlausvektor kann deshalb durch eine Virusresistenz der Pflanze oder/und durch ein Unvermögen des Vektors zur Übertragung des Virus (Vektorresistenz) bedingt sein. Daher wurde mittels EPG (electrical penetration graph) das Einstichverhalten des Hauptvektors Rhopalosiphum padi in Pflanzen eines virusanfälligen und des nichtinfizierbaren H. bulbosum-Klons untersucht und mit dem Saugverhalten auf H. vulgare Pflanzen ('Erfa', 'Vixen' und 'Post') verglichen. In der EPG-Methode wird eine geringe Gleichstromspannung an die Testpflanze angelegt. Die Aphiden werden über einen feinen Golddraht elektrisch leitend mit einem Eingangsverstärker verbunden und die Spannungsänderungen nach dem Einstechen des Styletts in das Pflanzengewebe verstärkt und aufgezeichnet. Die sich daraus ergebenden Spannungskurven ermöglichen Aussagen sowohl über den zeitlichen Ablauf des Blattlaussaugens wie Beginn und Ende des Einstiches, über den Einstichort (extrazellulär, intrazellulär, Phloem, Xylem) als auch über die Saugsaktivität (Saugen, Speichelabgabe). Insbesondere wurden die Zeiten bis zum Einstich in das Phloem und die beim Phloemsaugen auftretenden Muster (E1 und E2) ausgewertet. Erste Ergebnisse deuten an, dass bei dem nichtinfizierbaren Klon die E1 Phase, während der Speichel in das Phloem abgegeben wird, zeitlich verkürzt ist. Diese Phase wird als wesentlich für die Virusabgabe in die Pflanzen betrachtet.

W. Huth
Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11/12, D-38104 Braunschweig

Zur Bestimmung von Resistenzeigenschaften von Pflanzen gegenüber Pathogenen werden verschiedene Parameter und Kriterien herangezogen, von denen ein großer Teil nicht mit einer pflanzeneigenen, genetisch fixierten Widerstandsfähigkeit korreliert. Entsprechend der jeweils verwendeten Parameter werden die Reaktionen der Pflanzen auf Pathogenbefall unterschiedlich bewertet und ihre Resistenzeigenschaften oftmals sogar widersprüchlich eingeschätzt. Zu dieser Überzeugung haben jahrelange Untersuchungen an Gräsern und Getreide sowohl nach künstlicher als auch natürlicher Inokulation von Isolaten verschiedener Viren (z. B. BYDV, CYDV, BaYMV, BaMMV, RGMV, RGMoV) geführt. Berichtet wird über das Verhalten von Pflanzen mehrerer Sorten von Weizen, Gerste, Hafer und Lolium multiflorum nach Inokulation mehrerer Isolate von BYDV und CYDV unterschiedlicher Aggressivität. Alle Pflanzen aller Getreidearten und vermutlich aller Grasarten, so ein entsprechender Vektor zur Verfügung steht, sind mit beiden Viren infizierbar und damit ihnen gegenüber anfällig. Resistent sind demnach nur solche Pflanzen, die eine Infektion durch diese Viren tolerieren. Die Resistenzform dieser Pflanzen ist daher eine Toleranz. Die Ergebnisse belegen, dass die Toleranz aus der Wechselbeziehung zwischen Stoffwechselleistung der Pflanzen und Aggressivität (syn. Virulenz) der Pathogene resultiert. Die Toleranz einer Pflanze verringert sich graduell mit steigender Aggressivität des Pathogens. Dabei ist die Reaktion der Pflanzen aller geprüften Getreidearten und -sorten auf deren Befall gleichartig, jedoch abhängig vom Toleranzgrad der Pflanzen auf unterschiedlichem Niveau. Die Beurteilung der Toleranz/Resistenz von Pflanzen wird dadurch erschwert, dass die bereits durch Virusbefall gestressten auch tolerante Pflanzen abhängig von der Intensität weiterer, ggf. stressender Umweltfaktoren (z. B. Temperaturen) mit entweder verringerten oder auch erhöhten Wachstums- und Ertragsleistungen reagieren. Die Toleranz ist keine pathogenspezifische Eigenschaft der Pflanzen, sondern ist gegen mehrere Pathogene mit vergleichbarer Aggressivität gerichtet. Fazit: Eine Bestimmung von Resistenz-/Toleranzeigenschaften von Pflanzen gegenüber Pathogenen kann nur unter Einhaltung streng definierter Kriterien, Einbeziehung von Standardsorten und nicht infizierten Kontrollpflanzen durchgeführt werden. Pathogengehalt, Zahl infizierter Pflanzen u. a. können in den meisten Fällen keine Resistenzkriterien sein.

H.W. Karakacha and S.Winter
DSMZ, Abteilung Pflanzenviren, c/o BBA Braunschweig

A survey of African cassava mosaic disease (ACMD) was conducted in major cassava producing areas of East and Central Africa. Plant materials were analysed in the field by TAS-ELISA to discriminate amongst E-ACMV and ACMV. Mixed infections of the different begomoviruses and the presence of the, Uganda variant, recombinant virus (UgV) were tested using a combination of PCR reactions. Key objective for the survey was to determine the distribution particularly of UgV since this virus not only causes leaf symptoms but leads to the decline of the crop with a total loss of harvestable tubers. UgV was detected in Cassava samples from Kisangani area in the Democratic Republic of Kongo, providing evidence for the rapid spread of the disease towards West Africa. There, Uganda Variant was not present, however the East African Cassava Mosaic Virus was found infrequently in various countries but with no evidence for an epidemiological significance of this particular virus. In Uganda, the putative location where UgV originated, the virus was found in all Cassava growing areas moving towards East and South. In Kenya, samples from the western part reacted positively to all three viruses, ACMV, E-ACMV and UgV. In the coastal districts, only E-ACMV was found but no other begomovirus. In Western Kenya, UgV and ACMV occurred in mixed infections but only in combinations UgV and ACMV but never in mixes with E-ACMV. A detailed study on the distribution of UgV revealed that it became the prevalent virus displacing successively ACMV formerly being the only virus strain in this western region of Kenya, until UgV appeared. Comparing the distribution of the viruses in different Cassava growing areas, it became evident that spread especially of the most damaging UgV is mainly sustained by distribution of infected cuttings. In coastal areas, where Cassava production is scattered over a larger area and exchange of planting material was restricted, incidence of the Cassava mosaic disease was around 25%, compared to 100% in Cassava production areas of Western Kenya.

M. Koohi Habibi(1), M. Arbibi(1), K.Izadpanah(1) and S.Winter(2)
(1)Department of Plant Protection, Agricultural College, University of Theran, Iran, (2)DSMZ, Abteilung Pflanzenviren, c/o BBA Braunschweig

Johnsongrass chlorotic stripe mosaic virus (JCSMV) has been reported infecting Johnsongrass (Sorghum halepense) in Fars Province, Iran. Particle morphology, biochemical and physical properties of this virus resemble those of typical Tombusviridae however, a serological relationship to members of other Genera was not demonstrated. Unlike tombus- and carmoviruses, JCSMV is not transmitted either mechanically or by a vector, nor through seed. This unusual properties prompted the investigations on the molecular characterisation of the viral genome. RNA was extracted from viral purifications and the putative genomic size was estimated to be approximately 4,6 kb. cDNA was synthesized and cloned into pBlueskript. Sequence analysis of selected JCSMV cDNA clones revealed the closest relationship to pothos latent virus (PoLV), a virus found in Araceae and belonging to a new Genus Aureusvirus of the Tombusviridae. Although the size of the coat protein of JCSMV of approximately 40kD is similar to the coat protein of PoLV, a 65% nucleotide sequence identity of JCSMV to PoLV should suggest for classification of JCSMV as a separate virus species. This is further corroborated by the different transmission modes and host ranges of the two viruses. The unusual features of JCSMV and its relationship to other Tombusviridae are discussed.

C. Dietrich, E. Maiss und M. Varrelmann
Institut für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, Universität Hannover, Herrenhäuser Str. 2, 30419 Hannover

Kürzlich konnte gezeigt werden, dass das Gen der ß-Glucuronidase (GUS) in den infektiösen full-length Klon des PPV (p35PPV-NAT) als histochemischer Ausbreitungsmarker integriert werden kann (p35PPV-gus-CP). Dabei wurde das GUS-Gen mit minimalen N- und C-terminalen Fusionen ausgestattet und mittels der viruseigenen Protease (NIa) aus dem Polyprotein prozessiert (Varrelmann und Maiss, 2000). Das GUS-Markergen erlaubt jedoch keinen zerstörungsfreien Nachweis der Virusausbreitung. Weiterhin bleibt das GUS-Gen nach mechanischen Passagen nicht stabil im PPV-Genom integriert, sondern wird wahrscheinlich durch intramolekulare Rekombination entfernt. Um diese Nachteile umgehen zu können, wurde das Gen des Jellyfish green fluorescent protein (smRSGFP; Davis and Vierstra, 1998) mit einer vergleichbaren Strategie durch Einfügung von zusätzlichen Protease-Erkennungssequenzen zwischen dem Polymerase- (NIb) und Hüllprotein-Gen (CP) in das PPV-Genom integriert. Das erzeugte p35PPV-gfp-CP konnte Nicotiana benthamiana Pflanzen mittels Partikelbombardment systemisch infizieren. Die systemische Ausbreitung konnte mit Hilfe von Epifluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Nach einer mechanischen Übertragung konnte in neuinfizierten Pflanzen GFP-Aktivität nachgewiesen werden, das Gen wurde demnach nicht über Rekombination entfernt. Untersuchungen zum Fluoreszenznachweis der systemischen Ausbreitung in der gesamten Pflanze mit einer UV-Handlampe wie auch zu Mischinfektionen werden momentan durchgeführt. Davis, S.J. and Vierstra, R.D., (1998). Soluble, highly fluorescent variants of green fluorescent protein (GFP) for use in higher plants. Plant Molecular Biology 36, 521-528. Varrelmann, M. and Maiss, E., (2000). Mutations in the coat protein gene of Plum pox virus suppress particle assembly, heterologous encapsidation and complementation in transgenic plants of Nicotiana benthamiana. Journal of General Virology 81, 567-576.

N. Mielke, W.Benthack und H.-P. Mühlbach
Universität Hamburg, Institut für Allgmeine Botanik, Ohnhorststr. 18, D-22609 Hamburg

In weiten Teilen Europas beobachtet man Ebereschen mit chlorotischen Ring-flecken und Blattscheckungen. Das putative Agens ist pfropfungsübertragbar, was zusammen mit den charakteristischen Blattsymptomen eine Virus-erkrankung der Eberesche vermuten läßt. Eine Isolierung und charakterisieren des putativen Agens ist bis heute noch nicht gelungen. Aus verschiedenen Geweben (Blattern, Rinde, Blatt- und Blütenknospen) erkrankter Ebereschen konnte aber dsRNA isoliert werden, was den Verdacht der Virusinfektion erhärtet. Die einzelnen Gewebe wiesen dabei unterschiedliche dsRNA-Bandenmuster auf. Blatt-, Blattknospen und Blütenknospen-proben zeigten dabei Übereinstimmungen im dsRNA-Muster, während das dsRNA-Muster aus Rindenproben völlig abwich. Eine Mischinfektion der Eberesche kann aufgrund dieses Ergebnisses nicht ausgeschlossen werden. Aus symptomlosen Ebereschen konnte in keinem Fall dsRNA isoliert werden. Mit Hilfe des ECL-System war die direkte Markierung von dsRNA zur Sondenherstellung möglich. Mit einer ECL-markierten dsRNA-Sonde aus Blattproben und aus Rindenproben sollten die verschiedenen dsRNA-Muster in Northern-Hybridisierungen miteinander verglichen werden. Durch den Einsatz der dsRNA-Sonde aus Blattproben konnte das Blatt-spezifische dsRNA-Muster in Blatt-, Blattknospen und Blütenknsopen nachgewiesen werden, nicht jedoch in Rindenproben. Die dsRNA-Sonde aus Rindenproben detektierte ebenfalls das Blatt-spezifische dsRNA Muster in allen vier Geweben einschließlich der Rinde. Diese Ergebnisse lassen noch keine Aussage darüber zu. ob mehrere Viren an der Erkrankung der Eberesche beteiligt sind. Zur weiteren Charakterisierung des Erregers bzw. der virusspezifischen dsRNA konzentrieren sich unsere Arbeiten auf die cDNA-Synthese, Klonierung und Sequenzierung von dsRNA.

M. Sadowska-Rybak (1), C. Heinze (1), P. Willingmann (1), D. Brown (2) and G. Adam (1)
(1) Institut für Angewandte Botanik, Abteilung Pflanzenschutz, Universität Hamburg, Marseillerstr. 7, 20355 Hamburg, Germany.
(2) Scottish Crop Research Institute, Invergowrie, Dundee DD2 5DA, UK

Tobacco rattle virus (TRV) is the type member of the genus Tobravirus and economically important because of its broad host range that includes potato crops, tobacco plants and ornamental bulb. TRV consists of a bipartite +ssRNA genome encapsidated in long (RNA1) and short (RNA2) rod shaped particles. RNA1 encodes the genes for the replication and movement of the virus. RNA2 encodes always the viral coat protein (CP), which is responsible for the serological classification. TRV is naturally transmitted by root feeding nematodes. Furthermore, there is a highly specific relationship between virus and nematode, so that particular virus isolates are transmitted only by certain nematode vectors species. At present, serological methods are the first choice to detect and differentiate TRV in plants. A general PCR method for detection of TRV in plants was already established (Weidemann, 1995). In the following presentation potato samples (41) from different places from Germany were investigated on TRV serologically and by PCR. 16 samples were found to be positive, it was found serologically that 8 samples belongs to TRV RQ , 4 to TRV PRN and 1 sample was a mixed population consistent of TRV PRN and TRV RQ. The remaining 3 samples could not be characterized. To confirm the serological results, an attempt was made to design serotype specific TRV primer for the PCR diagnosis and for later use in the microarray technology. In order to do this, nucleotide sequences of the CP genes from each TRV species (TRV PRN, TRV TCM, PEBV etc.) were aligned separately, a consensus sequence was generated and used for primer design. This was done with the programm Genefischer (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher). The applicability of the primer was confirmed by PCR technique with defined TRV serotype and later on TRV infected potatoes. The results will be presented and discussed.

M. Wallbraun (1), A. Biedert (1), H. Busch (2) und G. Krczal (1)
(1) Staatliche Lehr- und Forschungsanstalt, Zentrum Grüne Gentechnik, 67435 Neustadt
(2) Deutsche Saatveredelung, Lippstadt-Bremen GmbH, 59557 Lippstadt

Die Entwicklung von Sorten mit einem verfrühten Blühzeitpunkt ist besonders für nördliche Klimaregionen interessant, um dort die kurzen Wachstumsperioden besser nutzen zu können. Der Übergang von der vegetativen Phase in die Blühphase hängt von endogenen und Umweltfaktoren ab, z.B. Temperatur, Tageslänge, Lichtqualität und Verfügbarkeit von Wasser und Nährstoffen ab. Fortschritte im molekularen und genetischen Verständnis des Blühvorgangs eröffnen nun die Möglichkeit, den Blühprozeß in transgenen Pflanzen zu modifizieren. Um eine Blühverfrühung in Brassica napus zu etablieren, wurde die cDNA des SPL3-Gen aus Arabidopsis thaliana unter der Kontrolle des 35S-Promotors in Raps exprimiert. Das SPL3-Gen kodiert einen vermeintlichen Transkriptionsfaktor, der an der Regulation eines Meristem-Identitäts-Gens in Arabidopsis beteiligt ist. Eine Überexpression des SPL3-Gens führte in Arabidopsis zu einer signifikanten Blühverfrühung. Für die genetische Transformation von Raps wurden Hypokotyle von Sommer- und Winterformen mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 pMP90 und auf DKW-Medium mit 25 mg/l Kanamycin selektiert. Die regenerierten Rapspflanzen wurden via PCR auf die erfolgreiche Integration des Transgens getestet. Über 25% der Regenerate zeigten in vitro einen Blütenansatz. Weitere molekularbiologische Analysen und die Bonitur der Blühzeitpunkte der transgenen Linien im Gewächshaus stehen noch aus.