Arbeitskreis
Viruskrankheiten der Pflanzen

Jill Engelmann und E. Maiss, Institut für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, Universität Hannover, Herrenhäuser Str. 2, 30419 Hannover

RNA vermittele Virusresistenz wird durch „Posttranscriptional Gene Silencing“ erreicht. Dabei wird eine de-novo-Methylierung der transgenen DNA beobachtet. Ob diese Methylierung Vorraussetzung, Beiprodukt oder eine Folge des PTGS ist, ist bislang ungeklärt. Um dieser Frage auf den Grund zu gehen, wurden mit unterschiedlich langen, virusabgeleiteten Sequenzen des Hüllprotein-kodierenden Bereiches PVY^NTN-resistente Nicotiana benthamiana-Pflanzen hergestellt. Im direkten Vergleich wurden am 3'-Ende jeweils synthetisch hergestellte CG₍₁₀₎-Paare, die klassische Ziele der Methylierung sind, angefügt, um so die Methylierung künstlich herauf­zusetzen. Anschließend wurde mittels Bisulfit-Modifikation der Methylierungsgrad der transgenen viralen Sequenz vor und nach Virusinfektion analysiert. Die Ergebnisse der Resistenztests und der jeweilige Grad der Methylierung der DNA werden vorgestellt und diskutiert.

M. Varrelmann (1), E. Maiss (2) und L. Palkovics (3), (1) Universität Göttingen, Institut für Pflanzenpathologie & Pflanzenschutz, Grisebachstr. 6, 37077 Göttingen, (2) Universität Hannover, Institut für Pflanzenkrankheiten & Pflanzenschutz, Herrenhäuser Str. 2, 30149 Hannover, (3) Department of Plant Pathology, Budapest University of Economic Sciences & Public Administration

Eine wichtige Funktion des potyviralen HCpro stellt die Unterdrückung des posttranskriptio­nalen „gene silencing“ (PTGS) dar. PTGS, auch „RNA-silencing“ genannt, ist neben der im­manenten Virusresistenz über Resistenzgene eine adaptive pflanzliche Resistenzantwort gegen mobile oder invasive RNAs. PTGS wird u.a. durch replizierende virale RNA aktiviert und führt zu einer sequenzspezifischen viralen RNA-Degradation. Pflanzenviren haben Proteine entwickelt (z.B. HCpro bei Potyviren), die das PTGS an unterschiedlichen Stufen des Mecha­nismus inhibieren. Damit besitzen diese viralen Proteine Funktionen von Pathogenitätsfaktoren und wirken z.B. in Mischinfektionen mit anderen Viren replikationsverstärkend. Für das HCpro von Potyviren ist bekannt, dass das Protein die Akkumulation der „short interfering“ RNAs (siRNAs) inhibiert, welche eine wichtige Komponente des Resistenzmechanismus darstellen. Die Suppressor-Aktivität des HCpro wurde in einem transienten, von Agrobakterien vermittelten Expressionstest in GFP-transgenen Nicotiana benthamiana bestimmt. Um Genbereiche des HCpro des Plum pox virus (PPV) zu identifizieren, die an der Suppressorfunktion beteiligt sind, wurde eine gesättigte Mutationsbibliothek mittels Transposon vermittelter Insertionsmutagenese hergestellt. Mit dieser Methode konnte mittels Agroinfiltrationsexperimenten eine Funktionskarte des HCpro des PPV erstellt werden. In weiteren Versuchen wurde eine Mutante des HCpro hergestellt, die in einem Motiv (PTK), welches für die Blattlausüber­tragung verantwortlich ist, verändert ist. Interessanterweise induzierte diese Mutante in Agro­infiltrationsexperimenten eine hypersensitive Resistenzreaktion (HR), wel­che darauf schließen lässt, dass das modifizierte HCpro von pflanzlichen Genprodukten er­kannt wird, die - ver­gleichbar mit dominanter Virusresistenz - lokalen Zelltod induzieren. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Zusammenhang einer möglichen Verbindung zwischen immanenter und adaptiver Virusresistenz diskutiert.

J. Schubert, P. Supp, Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, Institut für Resistenzforschung und Pathogendiagnostik Aschersleben, Theodor-Roemer-Weg 4, 06449 Aschersleben

Seit 2000 wurden am Standort Aschersleben der BAZ Feldversuche mit mehreren transgenen Kartoffellinien durchgeführt. Diese wiesen verschiedene Formen und Niveaus von Resistenz gegen das Potato virus Y (PVY) auf, basierend auf der Expression des Hüllprotein- bzw. verkürzten NIb-Gens des Virus. Die Infektion mit Viren erfolgte auf natürlichem Wege. Es zeigte sich, dass keine der Resistenzen stabil war. Es traten stets PVY-Isolate auf, die sie überwanden. In der Mehrzahl gehörten diese zum hochvirulenten Wilga-Stamm, so dass der Anbau dieser Linien zu einem vermehrten Auftreten dieses Stammes führte. Besonders häufig traten resistenzbrechende Isolate auf, wenn ein Mischanbau mit teilresistenten Klonen erfolgte. Wir vermuten, dass auf diesen eine Anreicherung virulenterer Virusformen erfolgt. Die erhöhte Virulenz der Isolate basierte nicht auf Änderungen in der Region des Transgens. Einige der Linien wiesen konstant höheren bzw. niedrigeren Befall mit Potato leafroll virus bzw. Potato virus S auf, aber keine Unterschiede im Befall mit PVM und PVA. Die transgenen Pflanzen wiesen keine Veränderungen in der Besiedlung mit Aphiden auf, weder die Zahl, ihre Vermehrungsrate noch das Artenspektrum betreffend. In einzelnen Jahren beobachtetes verstärktes Blattlausauftreten ließ sich in Folgejahren nicht bestätigen. RNA-Rekombinanten des PVY ließen sich nur auf den transgenen Klonen nachweisen. Die Rekombinationen traten an unterschiedlichen Abschnitten des Genoms auf. In einem Fall konnte mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Rekombinante zwischen rekombinanter und natürlicher viraler RNA nachgewiesen werden. Wir vermuten, dass die Rekombinationsrate von Viren in transgenen Pflanzen erhöht ist. Es ist zu prüfen, ob derartige Rekombinanten natürliche Resistenzen gegen das PVY überwinden können. Anhaltspunkte zu biologischen Risiken können erst nach mehrjährigen Untersuchungen gewonnen werden, da alle untersuchten Faktoren einer großen natürlichen Schwankungsbreite unterliegen.

D. Pohl, H. Jeske und C. Wege, Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Molekularbiologie und Virologie der Pflanzen, Pfaffenwaldring 57, D-70550 Stuttgart

Strict phloem limitation of the bipartite Abutilon mosaic virus (AbMV) in different host plants is accompanied by a lack of mechanical transmissibility. In order to analyse the functionality and thus contribution of movement proteins to tissue restriction, Nicotiana benthamiana plants were transformed with AbMV DNA B dimers and challenged by agroinoculation of AbMV DNA A. Several independent plant lines (generations T0 to T3) were capable of replicating and systemically spreading complete bipartite virus genomes, including free DNA B copies. In contrast to reports on other begomoviruses, transgenically expressed AbMV BC1 protein was not able to induce pathogenic symptoms permanently. Different transgenic lines containing functional DNA B copies and expressing BC1 protein indeed developed abnormal leaf phenotypes transiently, but later on recovered and were indistinguishable from wild-type plants. Upon AbMV infection, symptoms were the same in transgenic and wild-type plants, as was the amount of viral DNA accumulating in leaf tissues. Macroscopic and microscopic in situ hybridisation revealed that AbMV remained phloem-limited in the DNA B-transgenic plants. Nevertheless, mechanical transmission of the virus had changed: About one fifth of transgenic plants treated with sap from systemically infected wild-type N. benthamiana developed full AbMV infections. Thus AbMV DNA B genes BV1 and BC1 can complement for mechanical transmission in inoculated leaves, but in systemically infected leaves fail to support viral invasion of non-phloem cells. Since in mixed infections with CMV, AbMV has been shown to escape from the phloem, some other (perhaps gene silencing-) mechanism may be responsible for AbMV tissue limitation.

P. Münch (1), B. Alberter (1), H. Wajant (2), R. Eckert (1), H. Jeske (1) und C. Wege (1); (1) Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Molekularbiologie und Virologie der Pflanzen, Pfaffenwaldring 57, 70550 Stuttgart; (2) Universität Würzburg, Abt. Molekulare Innere Medizin, Medizinische Poliklinik, Röntgenring 11, 97070 Würzburg

In humanen Zellen wurde das Verhalten pflanzenviraler Genome, Promotoren und Proteine mit Hilfe klonierter Gemini- und Caulimovirus-DNA untersucht. Für Geminiviren, die in ihrer Organisation tier- und humanpathogenen Circoviren, aber auch den Polyomaviren wie SV40 besonders nahestehen, ergaben sich keine Hinweise auf eine Replikation in HeLa-Zellen. Auch konnte keine Aktivität für einen geminiviralen Hüllprotein-Promotor und für den besonders effizienten und somit in der pflanzlichen Gentechnik weit verbreiteten Caulimovirus-35S-Promotor nachgewiesen werden. Dieser Befund steht im Gegensatz zu einer unlängst veröffentlichen ähnlichen Studie, hielt aber einer Vielzahl von Positiv- und Negativkontrollen stand und wurde zudem mit einem besonders sensitiven Nachweissystem erbracht, nämlich der transienten Expression von Green Fluorescent Protein (GFP). Auf der Protein-Ebene zeigten sich hingegen weitreichende Übereinstimmungen im Verhalten von Geminivirus-Genprodukten in pflanzlichen und in humanen Zellen. Vergleichende Analysen mit zwei funktionell unterschiedlichen fluoreszenzmarkierten viralen Transportproteinen ergaben, dass beide Proteine sowohl in Petunien-Protoplasten als auch in HeLa-Zellen den ihnen jeweils eigenen Membrantropismus entwickelten. Durch Einsatz Organell- und Membrantyp-spezifischer Marker lassen sich daher pflanzenvirale Proteineigenschaften in den optisch und immunologisch sehr zugänglichen HeLa-Zellen gut beobachten.

A. Kadri (1), S. Balci (2), H. Jeske (1), K. Kern (2), A. Bittner (2) und C. Wege (1); (1) Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Molekularbiologie und Virologie der Pflanzen, Pfaffenwaldring 57, 70550 Stuttgart; (2) MPI für Festkörperforschung, Heisenbergstr. 1, 70569 Stuttgart

Selbst-assemblierende biologische Nanopartikel lassen sich als Matrizen (Template) zur Produktion von linearen oder röhrenförmigen Kleinst-Objekten verwenden. Solche Strukturen werden für nanoelektronische und biotechnologische Applikationen gebraucht. Besonders gefragt und ökonomisch sind dabei im Vergleich zu konventionellen Herstellungsverfahren Fabrikationsmethoden, die Selbstassemblierungsprozesse nutzen: Sie schneiden bezüglich Energieaufwand und Abfallproduktion am besten ab. Pflanzenvirus-Partikel sind gut charakterisierte bio-organische supramolekulare Komplexe. Sie sind sehr stabil und gut in vitro zu assemblieren. Durch Mutagenese der Nukleinsäuren stäbchenförmiger und filamentöser Viren lassen sich Partikel variabler definierter Länge mit veränderten Ladungseigenschaften erzielen, welche durch kontrollierte elektrochemische Metallisierung zu Nanodrähten und -röhren ("virowires") prozessiert werden können. Die entstehenden Protein-Metall-Kompositstrukturen lassen auf interessante physikalische Eigenschaften wie Leitfähigkeit, mechanische Charakteristika und Immobilisierbarkeit auf technisch interessanten Substraten hoffen. Eine Metallisierung von TMV-Partikeln mit Nickelionen erbrachte bereits Nanodrähte von 3 nm Durchmesser. Veränderungen des TMV-Hüllproteins sollen nun die Metallabscheidung gezielt beeinflussen, zunächst durch eine Punktmutation (E50Q) und eine C-terminale Verlängerung durch sechs Histidin-Reste. Virale Partikel konnten inzwischen auch erfolgreich durch In-vitro-Expression des TMV-Hüllproteins und Selbstassemblierung in nicht-pflanzlichen Systemen erzeugt werden. Somit wird die Produktion von veränderten Virusröhrchen künftig nicht mehr nur auf pflanzeninfektiöse TMV-Varianten beschränkt sein. Das erweitert die Möglichkeiten zur Entwicklung neuartiger viraler Bionanotemplate erheblich.

O.A. Ariyo (1,2), A.G.O. Dixon (2), G.I. Atiri(3) and S. Winter(1) (1) DSMZ-Plant Virus Division, Messeweg 11/12, Braunschweig, Germany, (2) IITA, PMB 5320, Ibadan, Nigeria, (3) University of Ibadan, Nigeria

Cassava mosaic disease (CMD) is a major constraint to cassava production in the tropics and subtropics. Breeding for virus resistance against this disease is hampered due to reliance of CMD screening on natural infection conditions and on virus types present at a given time and location. Therefore, inoculation with defined begomoviruses at an early stage in breeding for resistance will present a major improvement to the resistance development in cassava. All major begomoviruses causing CMD in Africa and a Sri Lankan cassava mosaic virus isolate from Kerala, India (SLCMV-[Ker]) were cloned, sequenced and partial multimers of DNA A and DNA B components were constructed for biolistic introduction into IITA improved cassava genotypes and Nigerian local landraces to study virus infection in resistant and susceptible cassava clones. Clones of East African cassava mosaic virus-Uganda variant (EACMV-UG2[Ka]) originating from Kenya were only infectious to the susceptible cassava genotype, TME 117, while pseudo-recombinants between DNA-A of EACMV-[KE-k2B] and DNA-B of EACMV-UG2[Ka] were also infectious to the newly improved cassava genotypes, 96/1039 and 96/0304 resulting in very severe and persistent symptoms. With these constructs, it was also possible to infect TME 3 and TME 4, with virus replication and symptoms expression in 2-4 leaves following the bombarded ones. However, virus infection was not sustained and the plants recovered from the infection with virus not detectable in symptom-free leaves. Similar results were obtained when cassava genotypes were biolistically inoculated with total DNA extracts from infected plants or when mixed infections were induced. In all cases, the resistance status in 96/1089A, TME 3 and TME 4 was not affected, while mixed virus infections resulted in severe synergistic symptoms in the susceptible TME 117. Cassava genotypes, 96/1089A, 96/0160, TME 3 and TME 4 proved highly resistant to all possible combinations of begomoviruses tested.

P. Cobanov (1), G. Nölke (2), M. Orecchia (2), P. Saldarelli (3), M. DellOrco (3), A. Minafra (3), G. Martelli (3), R. Fischer (2), S. Schillberg (2) und G. Reustle (1); (1) Centrum Grüne Gentechnik, DLR-Rheinpfalz, Breitenweg 71, 67435 Neustadt/W, (2) RWTH Aachen, Institut für Biologie VII, Worringerweg 1, 52074 Aachen, (3) Plant Virology Laboratory, Departement of Plant Protection, Via G. Amendola 165/A, 70126 Bari, Italy

Die Rebe ist anfällig gegen eine Vielzahl von Viren, darunter Nepoviren (GFLV, ArMV) und der Komplex der Blattrollkrankheit verursachenden Viren (GLRV, Clostero- und Ampeloviren). Einzige Möglichkeit eines dauerhaften Schutzes gegen Viruskrankheiten ist die Resistenz der Unterlagen und/oder Edelreissorten. Zwar liegt bei einigen Wildreben Virusresistenz vor, doch die klassische Kreuzungszüchtung stößt bei der Nutzung dieses Resistenzpotentials sehr schnell an ihre Grenzen. Die Gentechnik bietet verschiedene Möglichkeiten der Etablierung von Virusresistenz. Eine Möglichkeit ist die Expression rekombinanter Antikörper (scFv) in der Pflanze gegen virale Proteine. Wir haben als Antigene unterschiedliche virale Proteine (Replikase- und Movement-Proteinfragmente) in vitro exprimiert und mittels Phage Display spezifische scFvs selektiert. Ziel ist die rekombinante Expression dieser Antikörper um die Replikation und/oder Verbreitung der betreffenden Viren in der Pflanze zu unterbinden und damit eine Virusresistenz zu erzeugen. Wir stellen die Expression der verschiedenen Antigene, die Selektion der rekombinanten Antikörper, sowie Transformationsexperimente zur Etablierung scFv-exprimierender Reben vor.

Katja Richert-Pöggeler, Faiza Noreen and Thomas Hohn, Botanical Institute, Plant Health Unit, University of Basel, Schoenbeinstrasse 6, CH-4056 Basel, Switzerland

Petunia plants that harbor endogenous sequences of Petunia vein clearing virus (PVCV) cannot be distinguished phenotypically from those that are proviral free. Endogenous viral sequences of Banana streak (badna) virus (BSV) and Tobacco vein clearing (Cassava vein mosaic-like) virus (TVCV) can, under certain conditions, initiate viral infection after induction. In addition to known inducers of endogenous pararetroviruses, such as genome hybridization, tissue culture and abiotic stresses, we observed activation of PVCV after wounding. Preliminary data indicates that a low level of viral transcription from integrated PVCV copies occurs continuously but does not cause symptoms. Evidently, the virus found a niche within petunia. This could occur either by camouflage so the host does not recognize PVCV as “foreign” or by display at a minimal level which is neglected by the host. The obtained results provide evidence for the latter. Our data indicates that the host plant uses DNA methylation of cytosine residues in the CNG context for control of viral expression from endogenous PVCV sequences. This methylation pattern is restricted to coding regions and absent in the promoter region. Transient demethylation by incubation of germinating seeds with 5'-azacytidine, which inhibits methyltransferases, induced viral infection. Understanding and evaluating the impact of endogenous, infectious, pararetroviruses on the host genome will secure the production of genetically stable and disease-free plant material.

C. Heinze (1), D.-E. Lesemann (2), P. Willingmann (1) und G. Adam, (1) Universität Hamburg, Biozentrum Klein-Flottbek und Botanischer Garten, Abteilung Pflanzenschutz, Ohnhorststr. 18, 22609 Hamburg (2) Biologische Bundesanstalt, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11/12, 38104 Braunschweig

Innerhalb des Genus Tobamovirus gibt es Spezies, die sich serologisch, biologisch - die Viren infizieren hauptsächlich Plantago sp. und Cruciferen - und aufgrund von Sequenzähnlichkeiten von den anderen Spezies absetzen und deshalb in eine gesonderte Subgruppe eingeordnet werden. Innerhalb dieser gibt es aber keine eindeutige Zuordnung von Namen zu den einzelnen Isolaten. Neben den drei anerkannten Spezies Ribgrass mosaic virus (RMV), Turnip vein clearing virus (TVCV) und Oilseed rape mosaic virus (ORMV) gibt es weitere Bezeichnungen wie TMVcrucifer. Auch wird die Bezeichnung RMV für Isolate verwendet, die aufgrund von Homologien eher den Spezies TVCV oder ORMV zugeordnet werden müssten. Um diese Unsicherheiten zu beseitigen, wurden etwa 20 Isolate, die serologisch in die Subgruppe 3 eingeordnet wurden, charakterisiert und mit den Daten bereits charakterisierter Isolate verglichen. Die Hüllproteingene aller Isolate konnten - mit zwei Ausnahmen - durch RT-PCR amplifiziert und sequenziert werden. In einem Ähnlichkeitsdiagramm sind drei Gruppen zu erkennen, nach denen die Isolate den drei bisher etablierten Spezies zugeordnet werden können. Einen Sonderfall bildet das Streptocarpus flower break virus (SFBV).

D.-E. Lesemann (1) und S. Winter (2), (1) c/o Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11/12, D-38104 Braunschweig, (2) DSMZ, Abteilung Pflanzenviren, c/o BBA Braunschweig

Seit den frühen 90er Jahren haben Calibrachoa-Sorten als Beet- und Balkonpflanzen eine zunehmende Bedeutung neben den nahe verwandten Petunien gewonnen. Zunächst führte die vegetative Vermehrung ohne Viruskontrolle zu teils latenten, teils Blattsymptome und Wuchsdepressionen erzeugenden Virusinfektionen. Verwirrend war das zunächst sehr weit im Sortiment verbreitete, jedoch symptomatisch nicht erkennbare Calibrachoa mottle virus (CbMV). Dieses war bis zum Vorliegen eines spezifischen Antiserums nur mit Hilfe eines Antiserums gegen Saguaro cactus virus immunelektronenmikroskopisch nachweisbar. Weitere in unterschiedlich stark symptomatischen Pflanzen identifizierte Viren sind Tomato mosaic virus (ToMV), Tobacco mosaic virus, Cucumber mosaic virus, Potato virus Y (PVY) und Broad bean wilt virus 1. Versuche zur mechanischen Übertragung zeigten, daß CbMV unter unseren Bedingungen leicht übertragbar ist, jedoch keine Symptome hervorruft. Die auffälligsten Symptome verursachten ToMV und PVY. Bei den anderen genannten Viren waren undeutlichere Blattsymptome zu beobachten. Blütensymptome in Form von oft undeutlichen Farbbrechungen und Deformationen wurden bei Infektionen mit ToMV festgestellt. Mischinfektionen mit CbMV führten zu Symptomverstärkungen. Die Symptomausprägung war sortenabhängig. Hin­sicht­lich der Infektionen mit CbMV erschien eine Sorte resistent. Das bei uns inzwischen hergestellte Antiserum gegen CbMV erlaubt sorgfältige Viruskontrollen. Besonders für neu gezüchtete Sorten scheint heute der Durchseuchungsgrad reduziert zu sein. Phytosanitär kritisch dürften nur noch alte, nicht kontrollierte Sorten sein.

J. Schubert (1), K. Ellenberg (2), M. Nielitz (1), B. Lorenz (1), (1) Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, Institut für Resistenzforschung und Pathogendiagnostik Aschersleben , (2) Biolandhof Barum

Ziel der Bundesregierung ist es, für den ökologischen Landbau eine Quote von 20% zu erzielen. Das läßt sich nur erreichen, wenn geeignete Sorten vorhanden sind, für die der Verbraucher bereit ist, einen Mehrpreis zu zahlen. Bei der Kartoffel besteht die Problematik, dass viele geeignete alte Sorten existieren, die zwar für Verbraucher interessant sind, über deren Virusresistenz aber sehr widersprüchliche Angaben vorliegen. Sie sind meist stark virusverseucht. Ziel ist es, ein Verfahren zur Erzeugung erregerfreien Materials bei einem Biolandwirt zu etablieren und zu überprüfen, welche Sorten für den Ökolandbau unter dem Aspekt der Virusresistenz geeignet sind. Von den Ökostandorten Barum (Niedersachsen) und Aschersleben (Sachsen-Anhalt) wurden Knollen auf Virusbefall analysiert. PVX wurde nie nachgewiesen. Vorherrschendes Virus war PVY. Von den neueren Sorten blieben Satina, Ponto und Sibu weitgehend virusfrei, von den alten nur Blue Salat und Bamberger Hörnchen. Sorten, die noch nie einer Virusbereinigung unterzogen worden waren, wiesen auch Befall mit PLRV, PVM, PVS auf. Vornehmlich trat PVY^N auf, einige Sorten, z.B. Bonanza, wiesen jedoch stärkeren Befall mit PNY^NW auf. Als Problem erwies sich, dass einige Sorten falsch deklariert, nicht sortenrein oder von vornherein viruskontaminiert waren. Der hohe Virusbefall von Ökomaterial unterstreicht, wie wichtig es ist, erregerfreies Material zur Verfügung zu stellen. In einem Gazezelt wurden verschiedene Sorten mit 5 Isolaten des PVY^NTN unterschiedlicher geographischer Herkunft mechanisch inokuliert. Die meisten Sorten waren anfällig. Während anfällige neuere Sorten zur Nekrosenbildung neigten, konnte diese Erscheinung nicht bei den alten Sorten beobachtet werden. Besonders zwei neuere Isolate riefen sehr starke Nekrosen hervor. In Gewächshausversuchen konnten wir zeigen, dass auch Isolate des Wilga-Stammes in der Lage sind, bei bestimmte Sorten Nekrosen zu induzieren. Damit ist im Prinzip die Abgrenzung von PVY^NTN als separater Stamm hinfällig. Dieser Befund unterstreicht, dass verstärkt mit vom PVY hervorgerufenen Schäden zu rechnen ist.

D. Riedel, H. Stark, P. Dube. Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Am Fassberg 11, 37120 Göttingen

Transmissionselektronenmikroskope (TEM) werden verwendet um zweidimensionale Abbildungen von Zellen, Zellbestandteilen oder einzelnen Organellen darzustellen. Die Information eines TEM enthält jedoch die dreidimensionale Struktur der von den Elektronen durchstrahlten Probe. Um die räumliche Struktur der Proben bei hoher Auflösung zu erhalten, kann die dreidimensionale Information durch eine Tomographieserie oder aber über die single-particle-electron-microscopy-Methode sichtbar gemacht werden. Am Beispiel einer Tomographieserie eines Ultradünnschnittes einer kultivierten PC12 Zelle und der Struktur des icosahedrischen Tomato bushy stunt virus (TBSV) können die Möglichkeiten und Grenzen der Methode gezeigt werden. Der Vergleich der bekannten Kristallstruktur der einzelnen Hüllproteine bei einer Auflösung von 2.9 Å zeigt, dass die Abbildung der Massenverteilung aus dem TEM mit der Kristallstruktur vergleichbar ist.

W. Jelkmann (1) und J.R. Thompson (1, 2); (1) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenschutz im Obstbau, Schwabenheimer Straße 101, D-69221, Dossenheim, (2) Department of Plant Pathology, Cornell University, Ithaca, USA

Die vollständige Nukleinsäuresequenz des aphidenübertragbaren Isolates D74 des Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV) wurde ermittelt. Sie weist eine Ähnlichkeit von 86% zum nicht-aphidenübertragbaren Isolat MY-18, dem bislang einzig vollständig sequenzierten SMYEV-Isolat auf. Im Gegensatz zu MY-18 sind die 5'-terminalen Nucleotide (GAAAAC) von D74 typisch für die anderer Potexviren. Wie bei MY-18 bestätigte sich bei D74 die Abwesenheit eines AUG Codons für ORF2. Von MY-18 wurde in früheren Untersuchungen ein in vivo-infektiöser Klon unter Kontrolle des Cauliflower mosaic virus 35 S-Promotors hergestellt. Zwischen beiden Isolaten wurden Rekombinanten erstellt und deren Infektiosität untersucht. Im Rahmen von Untersuchungen zur Variabilität von SMYEV wurde für 23 Isolate ein 878 Nukleotide großer Abschnitt, der das Hüllproteingen und flankierende Regionen einschließt, sequenziert. Vergleiche der Nukleinsäuren ergaben Ähnlichkeiten von 84.6% bis 99%. Eine phylogenetische Analyse der Hüllproteingene zeigte, dass die Isolate drei Gruppen zugeordnet werden konnten. Sie wurden mit I (Typ-D74), II (Typ-9Redland) und III (Typ-MY18) bezeichnet. Auf Gruppe I entfallen 15 Isolate aus Europa sowie Nord- und Südamerika. Gruppe II umfaßt 5 Isolate und Gruppe III wurden 4 Isolate zugeordnet, davon das Isolat MY-18. Alle Isolate der Gruppen II und III wurden auf dem amerikanischen Kontinent isoliert. Der in früheren Untersuchungen zu MY-18 postulierte ORF6 von 11 kDa konnte in keinem der sequenzierten Hüllproteingene, einschließlich D74, gefunden werden.

R. Koenig (1), E. Pfeilstetter (2), D.-E. Lesemann (1) und S. Winter (3), c/o Biologische Bundesanstalt (BBA), Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicher-heit, Messeweg 11, 38104 Braunschweig, (2) BBA, Abteilung für nationale und internationale Angelegenheiten der Pflanzengesundheit, (3) DSMZ, Abteilung Pflanzenviren, c/o BBA

Das Genom der Tobraviren, zu denen u.a. das Tobacco rattle virus (TRV) und das Pea early browning virus (PEBV) gehören, besteht aus zwei RNAs. Auf der RNA 1 befinden sich u.a. die Replikase- und die Transportprotein-Gene. Während die RNAs 1 von verschiedenen TRV-Stämmen fast identisch sind, zeigen die RNAs 2 sehr große Unterschiede sowohl in der Größe als auch in der Basenzusammensetzung. Am 3'-Ende besitzen sämtliche RNAs 2 einen in der Größe sehr variablen RNA 1-ähnlichen Teil. Der RNA 2-spezifische Teil der TRV RNAs 2 kann ein bis vier offene Leseraster enthalten, von denen das 5'-proximale das Hüllprotein-Gen darstellt. In Alstroemerien, die durch starke Blattfleckigkeit, Blattmissbildungen und Zwergwuchs aufgefallen waren, fanden wir zwei verschiedene TRV RNA 2 Typen (TRV-AlsA RNA 2 und TRV-AlsB RNA 2). Im RNA 2-spezifischen Bereich zeigen beide RNAs eine fast hunderprozentige Sequenz-Identität mit der RNA 2 des TRV Tulpen-Isolates TCM, auf der sich zwei offene Leseraster befinden. Bei der TRV-AlsA RNA 2 endet die RNA 2-spezifische Sequenz allerdings c.160 nt eher als bei der TRV-TCM RNA 2, während sie sich bei der TRV-AlsB RNA 2 in einem dritten offenen Leseraster fortsetzt, dessen Genprodukt Ähnlichkeiten mit den ORF 3-Genprodukten unseres Spinat-Isolates SP und eines Nematoden-Isolates Pay4 zeigt, nicht aber mit den ORF 3-Genprodukten verschiedener anderer Tobraviren. Die 3'-terminale TRV RNA 1-ähnliche Sequenz besteht bei der TRV-AlsA RNA 2 nur aus 528 nt, während sie bei der TRV-TCM RNA 2 aus 1098 nt besteht. Bei der TRV-AlsB RNA 2 findet sich am 3'-Ende überraschenderweise eine Sequenz, die dem 3'-Ende der PEBV RNA 1, nicht aber dem der TRV RNA 1 sehr ähnlich ist.

Hanaa Hasan and E. Maiss, Institut für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, Universität Hannover, Herrenhäuser Str. 2, 30419 Hannover

Beet Mosaic virus (BtMV) is a member of the large and economically important genus Potyvirus of the Potyviridae. Virus-specific primers and a 26mer oligonucleotide, containing a random hexamer sequence at its 3'-end, were used for synthesis and amplification of cDNA fragments by RT-PCR. The fragments were cloned in T-vectors and the complete genome of BtMV was determined. The BtMV genome comprises of 9592 nucleotides (nts) and contains one large open reading frame (ORF) encoding a polyprotein of 3085 amino acid residues. The 5'- and 3'-untranslated regions were determined with 166 and 171 nts, respectively. Nine putative proteolytic cleavage sites were identified resulting in ten mature proteins: P1, HC-Pro, P3, 6K1, CI, 6K2, NIa, VPg, NIb, and CP, which are typical for all members of the genus Potyvirus. Alignment of the predicted polyprotein amino acid sequence with other potyviruses revealed amino acid sequence motifs typical of potyviruses but also some differences and so far undescribed motifs. Phylogenetic analysis clearly showed BtMV as a distinct member of the genus Potyvirus, sharing the highest amino acid sequence identity (55%) with Peanut mottle virus.

W. Jarausch, A. Baßler, N. Molla, B. Jarausch und G. Krczal, Centrum Grüne Gentechnik, DLR Rheinpfalz, Breitenweg 71, 67435 Neustadt/W.

In den Jahren 2000 bis 2003 wurden in den wichtigsten Steinobstanbaugebieten Südwestdeutschlands Felduntersuchungen zum Auftreten von Plum pox virus (PPV) durchgeführt. Ziel war die Untersuchung der Variabilität der PPV-Stämme. Hierzu wurde in über 200 Proben von Pflaume, Pfirsich, Aprikose, Mirabelle und von wilden Prunus-Arten der PPV-Stamm serologisch und molekular charakterisiert. Die serologische Typisierung erfolgte mittels PPV-Stamm-spezifischer monoklonaler Antikörper. Die molekulare Charakterisierung wurde zunächst mit RT-PCR-RFLP mit 9 verschiedenen Restriktionsenzymen durchgeführt. Für ausgewählte PPV-Isolate wurde anschließend ein 1,2 kb Fragment des NIb/CP-Gens sequenziert. Der überwiegende Teil der Isolate konnte dem PPV-D-Typ zugeordnet werden. Darüber hinaus wurden erstmals M-Stämme des PPV Südwestdeutschland in drei verschiedenen Anbaugebieten nachgewiesen. Die Sequenzanalysen zeigten, dass es sich dabei um mindestens zwei verschiedene Subtypen des M-Stammes handelt. Während eine Gruppe von Isolaten Ähnlichkeit zu osteuropäischen rekombinanten M-Stämmen aufwies, hatte ein Isolat große Ähnlichkeit mit südeuropäischen M-Stämmen. Die M-Stämme wurden ausschließlich auf Pflaume gefunden, wobei die befallenen Bäume durch eine ungewöhnlich starke Symptomausprägung auffielen. Bei einer genaueren Untersuchung im Anbaugebiet Ortenau wurde festgestellt, dass PPV-M in zwei Drittel der untersuchten Anlagen nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PPV-M in Südwestdeutschland bereits weiter verbreitet ist als bislang angenommen.

T. Kühne (1), G. Proeseler (2), A. Habekuß (2), K. Kanyuka (3), (1) Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, Institut für Resistenzforschung und Pathogendiagnostik, (2) Institut für Epidemiologie und Resistenz, Theodor-Roemer-Weg 4, 06449 Aschersleben, (3) Rothamsted Research, Harpenden, Hertfordshire AL5 2JO, UK

Die Gelbmosaikvirose der Wintergerste lässt sich nur durch den konsequenten Anbau resistenter Sorten bekämpfen. Die Resistenz gründete sich lange Jahre ausschließlich auf das rym4-Gen, das, trotz kürzlicher Einführung des rym5-Gens in das Sortiment, auch heute noch in breitem Umfang genutzt wird. Sie wurde aber bereits Ende der 80er Jahre durch das Isolat BaYMV-2 durchbrochen, welches bislang weder serologisch noch auf der Nukleinsäureebene vom ursprünglichen BaYMV-1 unterschieden werden konnte. Inzwischen ist gezeigt worden, dass die Fähigkeit zur Resistenzbrechung durch die RNA1 des BaYMV-2 bestimmt wird. Die vergleichende partielle Sequenzierung der RNA1 von 7 Isolaten des BaYMV-1 und 8 Isolaten des BaYMV-2 aus Deutschland und England offenbarte eine Korrelation zwischen dem jeweiligen Pathotyp und einem Basenaustausch in der Position 4094, der den Wechsel der Aminosäure Lysin (BaYMV-1) in Asparagin bzw. Histidin (BaYMV-2) im VPg zur Folge hat. Jüngste Untersuchungen an einigen Potyviren haben gezeigt, dass durch Modifizierung dieses multifunktionellen Nichtstrukturproteins Resistenzen in Pflanzen überwunden werden können. Da Resistenz gegenüber Potyviren häufig auf rezessive Gene zurückgeht, wurde die Hypothese entwickelt, wonach das VPg bei einer kompatiblen Reaktion in der Lage ist, mittelbar oder unmittelbar mit dem Produkt des jeweiligen dominanten Allels zu interagieren. In einer bezüglich des rezessiven Resistenzgens homozygoten Pflanze kann nur das modifizierte VPg der resistenzbrechenden Isolate (BaYMV-2) mit dem pflanzlichen Genprodukt reagieren und damit die Infektion auslösen.

N. Mielke (1), W. Benthack (1), C. Büttner (2), H.-P. Mühlbach (1). (1) Universität Hamburg, Biozentrum Klein Flottbek und Botanischer Garten, Ohnhorststraße 18, 22609 Hamburg; (2) Humboldt-Universität zu Berlin, Landwirtschaftlich-Gärtnerische Fakultät, Institut für Gartenbauwissenschaften, Fachgebiet Phytomedizin, Lentzeallee 55-57, 14195 Berlin

Eine weitverbreitete Erkrankung der Eberesche (Sorbus aucuparia L.), die sich in einer chlorotischen Scheckung der Blätter sowie chlorotischen Ringflecken äußert, läßt aufgrund der Symptomatik und der nachgewiesenen Pfropfübertragbarkeit (Führling und Büttner, 1995) auf eine Virusinfektion schließen. Serologische und elektronenmikroskopische Ansätze zur Identifizierung des Erregers blieben bislang jedoch erfolglos. Ausgehend von isolierter dsRNA und deren Amplifikation über DOP-PCR ist es zunächst gelungen eine 3.7 kb lange Sequenz zu erhalten. Datenbankanalysen zeigten Homologien zur RdRP verschiedener Vertreter der Bunyaviridae, die fünf konservierten Motive A-E konnten eindeutig identifiziert werden. Über die Etablierung eines geeigneten RACE-Verfahrens wurden die Enden dieser 7.0 kb langen viralen RNA erhalten. Die Sequenzierung zeigte, wie auch charakteristisch für die Familie Bunyaviridae, homologe Terminussequenzen, welche die Ausbildung einer 'panhandle-Struktur' ermöglichen. Der Einsatz von Primern, die diesen Terminus beinhalten, in der RT-PCR führte zur Identifizierung von drei weiteren viralen RNAs von 2.3, 1.6 und 1.3 kb, deren ORFs einen putativen Glykoproteinprecursor, das putative Nucleocapsidprotein sowie ein weiteres unbekanntes Protein kodieren. Die Homologievergleiche auf der Basis der erhaltenen Sequenzinformation reichen jedoch nicht aus, um das Virus phylogenetisch einer bestehenden Gattung oder Familie zuordnen zu können.

K. Dietrich und S. Winter, DSMZ, AG Pflanzenviren, Braunschweig

Zur Charakterisierung der Resistenz von Cassavazuchtlinien gegen Begomoviren sollen deren Konzentration, Ausbreitung und Replikation quantifiziert werden. Primer zur Amplifizierung von viralen DNA-A Sequenzen und von 18S rDNA, als endogene Kontrolle zur Standardisierung der PCR, wurden ausgewählt. Die quantitative PCR wurde mit sog. „double-dye“-Sonden durchgeführt und zunächst mit Plasmid-DNA normiert. Als Testlimit wurde eine theoretische Nachweisgrenze von 10-14 Molekülen ermittelt. Die Viruskonzentration in der resistente Cassavazuchtlinie TME 4 und der anfälligen Vergleichslinie TME 117, die durch biolistische Inokulation mit klonierter Begomovirus-DNA infiziert waren, wurden mittels der real-time-PCR quantifiziert. Während in TME 117 im Infektionsverlauf die Virusgehalte auf einem gleich bleibend hohen Niveau blieben, zeigten die Viruskonzentrationen in TME 4 starke Schwankungen. Besonders in symptomlosen Blättern der resistenten Linie wurden Viruskonzentrationen von kaum detektierbar bis zur 1000-fachen Konzentration des Referenzwerts gemessen. Mittels quantitativer PCR wurde Virusreplikation auch in resistenten TME 4 Pflanzen gemessen. Im Vergleich zu anfälligen Pflanzen erholte sich die resistente Zuchtlinie sukzessive von Symptomen und von Virusinfektion, und später gebildete apikale Pflanzenbereiche blieben virusfrei.

I. Fahmy Farouk, I. Abdullahi and S. Winter, DSMZ Plant Virus Division, c/o BBA, Messeweg 11-12, 38104 Braunschweig, Germany

To investigate the cellular mechanisms of transmission and the molecular interactions between begomoviruses and its whitefly vector, acquisition and translocation of Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV) by Bemisia tabaci was studied. A whitefly transmissible WmCSV isolate from Sudan and a non-transmissible mutant carrying a single amino acid change in the capsid protein at position 131 was used in the translocation experiments. Whiteflies were given an acquisition access feeding period of 48 h on infected watermelon plants and then kept on non-host plants for 48 h, followed by an inoculation access feeding on watermelon seedlings. WmCSV transmission was taken as evidence of a viable interaction between virions, the gut membrane and the accessory salivary glands (ASG). Freshly dissected organs of viruliferous whiteflies feeding on wild-type or mutant virus were examined by PCR to determine the presence of virus. For the transmissible, wild-type virus a pathway similar to luteovirus-aphid interactions and to TYLCV translocation in B. tabaci was found. Virus is ingested with phloem sap through the stylet, transported through the oesophagus and concentrated in the filter chamber, subsequently transported through the gut wall into the hemocoel, to reach the ASG. The virus is translocated in the salivary duct and is finally excreted with the saliva for plant inoculation. WmCSV was detected in the midgut and in the hemocoel as well as in the salivary glands of B. tabaci for both the transmissible and non-transmissible mutants. In the non-vector whitefly Trialeurodes vaporariorum, wild-type WmCSV was not capable of crossing the gut wall and hence not detected in the hemocoel or salivary glands. Since the ASG plays the most significant role for WmCSV transmission, further studies will concentrate on the definition of putative receptor sites in this organ.

V. W. Fomitcheva (1), V. Valkov (2), C. Münnich (2), I. Saalbach (2), U. Conrad (2), J. Kumlehn (2), J. Schubert (1). (1) BAZ, Institut für Resistenzforschung und Pathogendiagnostik, Theodor-Roemer Weg 4, 06449, Aschersleben, (2) Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Corrensstrasse 3, 06466 Gatersleben

Recombinant antibodies, such as single chain variable fragments (scFv's) directed against virus coded proteins which play a key role in the replication process, such as viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), and addressed to the right cell compartment may be used to protect plants against viral diseases. In an attempt to develop a broad-spectrum genetic protection against economically important plant viruses, an scFv was engineered which was able to recognise the conserved functional RdRp domain of (+)RNA viruses of plants. A functional scFv has been derived from phage display libraries Tomlinson J following alternate use of recombinant RdRp of Potato Y virus and Barley yellow dwarf virus as antigens for panning. In total four rounds of selection were performed. After establishing scFv expression in E. coli and confirming specificity of its reaction with recombinant and native viral proteins from BYDV- and PVY-infected plants by immunochemical analysis, the scFv-coding gene was applied for the construction of transgenic barley and N. benthamiana plants. So far, expression of scFv was detected in N. benthamiana. Testing for resistance to several viruses is in progress.

A.M.A. Gadelseed (1,2), I. Abdullahi(1), G.A. Dafalla (2) and S. Winter(1). (1) DSMZ Plant Virus Division, c/o BBA, Messeweg 11-12, 38104 Braunschweig, Germany, (2) Plant Pathology Center, Fac. of Agric. Sci, Gezira University, P.O. Box 20, Wad Medani, Sudan.

To investigate the biochemistry of whitefly vector and virus interactions leading to successful begomovirus transmission, proteins extracted from Bemisia tabaci insects were reacted with purified virus preparations of Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV). Upon SDS-PAGE of total B. tabaci protein extracts followed by virus overlay, five polypeptide species, 63, 51.3, 29.5, 26.3, and 25.7 kDa, were identified specifically reacting with purified WmCSV. None of these proteins reacted with preparations of a purified tombusvirus or with antibodies against the 65 kDa GroEl protein, a bacterial protein often found in Bemisia tabaci and often connected with whitefly transmission. Similar proteins to those from B. tabaci were also identified from non-vector insects (Trialeurodes vaporariorum and Aphis craccivora); however, the 29.5 and 26.3 kDa protein reactions were only found in B. tabaci. Attempts to localize the proteins to head or abdominal regions revealed that the large 63 and 51.3 kDa proteins are found similarly in both B. tabaci and T. vaporariorum. However, it remains to be shown which of these proteins are associated with the circulative transmission of WmCSV, especially which of the proteins mediate virus translocation across midgut and salivary gland barriers.

Tatjana Kleinow (1), Sabine Frischmuth (1), Achim Aberle (1), Christina Wege (1), Dieter Hülser (2), Holger Jeske (1). (1) Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Abt. Molekularbiologie und Virologie der Pflanzen, Pfaffenwaldring 57, 70550 Stuttgart, (2) Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Abt. Biophysik, Pfaffenwaldring 57, 70550 Stuttgart

Die Proteine der DNA B, BC1 (Movement-Protein, MP) und BV1 (Nuclear-Shuttle-Protein, NSP), des Abutilonmosaikvirus (AbMV) sind für den viralen Transport essentiell und Determinanten der Pathogenität. Beides setzt Wechselwirkungen sowohl zwischen ihnen als auch mit Wirtsproteinen voraus. Interaktionen zwischen BC1/MP und BV1/NSP wurden im Hefe-Zwei-Hybrid-System (Gal4-basiert, Wechselwirkung im Zellkern, Clontech) und dem Hefe-Cytotrap-System (Ras-basiert, Wechselwirkung an der Plasmamembran, Stratagene) untersucht. In beiden Systemen kommt es bei positiver Interaktion zur Aktivierung von Reportergenen, die zu His-Prototrophie und ß-Galaktosidase-Aktivität (Gal4-System), bzw. zu Wachstum unter selektiven Temperaturbedingungen (Cytotrap-System) führen. Im Gal4-System zeigte sich durch Gefrierbruchtechnik in Kombination mit Immun-Gold-Markierung eine Lokalisation von BC1/MP an der Plasmamembran, obwohl es hier mit einem Kernlokalisierungsmotiv fusioniert ist. Für BV1/NSP wurde eine Lokalisation im Zellkern nachgewiesen. Bei Ko-Expression beider Proteine in der Hefezelle wies diese ein reduziertes Wachstum und Zeichen von Autolyse auf. Beide Proteine trafen sich also nicht im selben Zellkompartiment und scheinen in der Ko-Expression unverträglich für die Zelle zu sein. Im Cytotrap-System zeigte BC1/MP eine Autoinduktion des Detektionssignals für Interaktion, was darauf hinweist, dass es alleine in der Lage ist Effektorproteine an die innere Seite der Plasmamembran zu binden. Wurde bei BC1/MP die zuvor identifizierte Membranbindungsdomäne deletiert, unterblieb die Autoinduktion. Mit Hilfe von Deletionsklonen der Membrandomäne konnte in beiden Hefesystemen eine Homo-Oligomerisierung der C-terminalen Region von BC1 nachgewiesen werden, aber keine direkte Interaktion von BC1 und BV1 gefunden werden.

R. Krämer (1), F. Marthe (1), E. Klocke (1), U. Ryschka (1), G. Schumann (1), J. Schubert (2), F. Rabenstein (2). Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, (1) Institut für gartenbauliche Kulturen, Neuer Weg 22/23, D-06484 Quedlinburg; (2) Institut für Resistenzforschung und Pathogendiagnostik, Theodor-Roemer-Weg 4, 06449 Aschersleben.

Vor dem Hintergrund dauerhafte Resistenz gegen Turnip mosaic virus (TuMV) in Kohlgemüse einzulagern, wurden Resistenzdonoren aus Brassica oleracea L. und Raphanus sativus L. entwickelt. In einer Weißkohl-Landsorte konnten durch sukzessive Einzelpflanzenselektionen (TuMV-Isolat 2, Pathotyp 4) vier homozygot resistente Linien (I₈) etabliert werden. In zwei B. oleracea-Primitivformen wurden insgesamt sieben homozygote Linien (I₆) mit Resistenz gegen einen Mix aus fünf TuMV-Isolaten (Pathotypen: 1, 4 und 6) selektiert. Die Resistenz in den Linien war auch unter Feldbedingungen (natürlicher Infektionsdruck) stabil (Pflanzen symptomfrei, DAS-ELISA negativ). Die TuMV-Resistenz aus R. sativus wurde durch somatische Hybridisierung in Raphanobrassica übertragen. Der Anteil resistenter Pflanzen (TuMV-Isolat 2) lag hier zwischen 11,1 und 63,8 %. Bei Pflanzen der Kombination PF 137 (B. oleracea [+] R. sativus 20/9) gelang es, die Bastardsterilität zu überwinden und aus acht Pflanzen über die Embryokultur 37 F₁-Nachkommen zu erzeugen. In der F₅-Generation wiesen 82,4 % der Pflanzen Resistenz gegen das TuMV-Isolat 2 auf. Zur Charakterisierung der Resistenz in den B. oleracea-Linien bzw. Raphanobrassica-Hybriden wurde die Ausbreitung / Verteilung des TuMV in den Pflanzen untersucht. In anfälligen Kohlpflanzen, die systemische Symptome aufwiesen, war das Virus in allen Pflanzenteilen auch 231 dpi nachweisbar (DAS-ELISA, Biotest mit Nicotiana glutinosa). Hingegen waren die als resistent selektierten Pflanzen virusfrei. In Raphanobrassica-Hybriden (Kombination PF 137, F₅) traten unterschiedliche Resistenztypen auf. Pflanzen bei denen kein Virus nachweisbar war (14,3 %) wurden dem Resistenztyp 0 (extreme Resistenz) und Pflanzen mit lokaler Infektion (81,0 %) dem Resistenztyp R zugeordnet. Als anfällig mit systemischer Virusausbreitung konnten 4,7 % der Pflanzen (Kombination PF 137, F₅) eingestuft werden.

F. Rabenstein (1), J. Schubert (1), F. Ehrig (1), T. Kühne (1), D. C. Stenger (2) und R. French (2), (1) Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, Institut für Resistenz-forschung und Pathogendiagnostik, Theodor-Roemer-Weg 4, 06449 Aschersleben, (2) USDA-ARS and Department of Plant Pathology, Lincoln, USA

Ein flexibles, fadenförmiges Virus, das aus Zuchtklonen des Knaulgrases (Dactylis glomerata L.) isoliert werden konnte, wurde näher charakterisiert. Das Isolat wurde aus Lokalläsionen (LL) von Chenopdium quinoa Willd. (Filterpflanze) erhalten, durch mechanische Inokulation auf Hafer vermehrt und für die Herstellung von Antiseren mittels Ultrazentrifugation gereinigt. Außer auf C. quinoa war das Virusisolat auch auf C. murale L. (LL), nicht jedoch auf 9 weitere Chenopodiaceae und 18 andere dikotyle Pflanzen übertragbar. Von 8 Arten aus der Familie Poaceae reagierten nur Avena sativa L. und D. glomerata mit der Bildung von Symptomen. Die Gerstensorte 'Xenia' wurde latent infiziert. Serologische Untersuchungen ergaben keine Beziehungen zum Cocksfoot streak virus und weiteren Mitgliedern des Genus Potyvirus. Ein Antiserum gegen dieses bisher unbekannte Virus zeigte im Western blot eine Kreuzreaktion mit zwei Viren der Gattung Tritimovirus, Oat necrotic mottle virus (ONMV) und Wheat streak mosaic virus (WSMV), jedoch nicht mit Brome streak mosaic virus (BrSMV). In Ultradünnschnitten infizierter Haferpflanzen konnten charakteristische Einschlusskörper (pinwheels) beobachtet werden, die Ähnlichkeit zu den vom BrSMV induzierten Strukturen aufwiesen. Durch Sequenzanalysen der für das CP- und NIb-Gen codierenden Bereiche konnte die enge verwandtschaftliche Beziehung zum ONMV bzw. WSMV betätigt werden. Erste phylogenetische Analysen lassen jedoch erkennen, dass es sich bei dem Virus aus Dactylis um ein eigenständiges Mitglied der Gattung Tritimovirus handelt, für das die Bezeichnung Cocksfoot streak mosaic virus vorgeschlagen wird.

B. Krenz und H. Jeske, Universität Stuttgart, Biologisches Institut, Molekularbiologie und Virologie der Pflanzen, Pfaffenwaldring 57, D-70550 Stuttgart;

Eukaryotische Zellen können zellfremde RNA abbauen und dadurch effizient die Expression fremder genetischer Elemente verhindern. Dieses Phänomen wird bei Pflanzen als Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) bezeichnet und ist durch das Auftreten von small interfering (si) RNAs charakterisiert, die den spezifischen Abbau von sequenzhomologen RNAs im Zytoplasma einleiten. Für AC2 und AV1 in Abutilonmosaikvirus(AbMV)-infizierten N. benthamiana konnte siRNA erstmals nachgewiesen werden. Damit wurde gezeigt, dass eine normale systemische Infektion mit AbMV in der Pflanze PTGS auslöst. Auch in mit Indian cassava mosaic virus infizierten Pflanzen konnten spezifische siRNAs nachgewiesen werden, so dass man allgemein auf ein Auslösen von PTGS gegen Geminivirus-Infektionen schließen kann. Demnach müssen Geminiviren einen Abwehrmechanismus besitzen, um sich dem PTGS zu entziehen, entweder durch den postulierten Silencing-Suppressor AC2 oder durch andere Strategien.

R. Ebel, A. Schnabel, G. M. Reustle, G. Krczal, and T. Wetzel. Centrum Grüne Gentechnik, DLR Rheinpfalz, Breitenweg 71, 67435 Neustadt/W., Germany

Together with Grapevine fanleaf virus and Arabis mosaic virus, Raspberry ringspot virus (RRV) is one of the causal agents of grapevine fanleaf disease, one of the most widespread and damaging virus diseases of grapevine. Fanleaf disease represents the main problem in grapevines in the wine producing areas of south-west Germany. Two different serological strains of RRV exist: the cherry strain (RRV-ch) and the grapevine strain (RRV-g) which occur in Germany and Switzerland. RRV belongs to the genus Nepovirus of the Comoviridae. Nepoviruses have two genomic RNAs (RNA1 and RNA2). Both have a genome-linked protein (VPg) at the 5' end and are polyadenylated at the 3' end. RNA1 and RNA2 have one open reading frame (ORF) flanked by a non-coding region at the 5' and 3' ends. The ORFs encode one large polyprotein which is proteolytically cleaved in smaller functional proteins. Both RRV strains were propagated in Chenopodium quinoa. The viral RNAs were purified, cDNA synthesized, cloned and sequenced. The sequences were compared and multiple alignments were performed using DNASTAR (DNASTAR, Inc). An online search for homologies using the BLAST network server was also carried out. Full-length clones of the RNA1 and RNA2 of RRV-g were constructed under the control of the 35S promoter, and tested for their infectivity. In preliminary experiments of mechanical inoculation onto Chenopodium quinoa, only the inoculated leaves were ELISA-positive but symptomless. No systemic infection could be detected. However, when the ELISA-positive leaves were reinoculated onto Chenopodium quinoa, a systemic infection took place within a week.

A. Massah (1), S. Winter (2), A.Afsharifar (1), A. Ahoonmanesh (3) and K. Izadpanah (1). (1) Plant Virus Research Center, Department of Plant Protection, Shiraz University, Shiraz, Iran, (2) DSMZ, Plant Virus Division, Braunschweig, (3) Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Isfahan University of Technology, Isfahan, Iran

The Iranian maize mosaic rhabdovirus (IMMV) presents a serious threat to the cultivation of maize in Iran. It infects wheat, barley, rice and several wild grasses. We are in the process of elucidating the complete nucleotide sequence of this virus which is determined from cDNA clones of both the viral genomic and messenger RNAs. The negative-sense, single-stranded RNA genome of IMMV, which is approximately 11 kb in size, shows 3' leader and 5' trailer regions and characteristic intergenic sequences (consensus) separating genes that are typical for nucleorhabdoviruses. The IMMV genome appears to contain five open reading frames (ORF) coding for virion proteins, and the proposed genomic map is 3'-N-M2-M1-G-L-5', where N is the nucleoprotein gene, M1 and M2 are matrix protein genes, G codes for a glycoprotein and L is the proposed transcriptase gene. IMMV appears to have low but distinct similarities to other rhabdoviruses so far sequenced.

G.M. Reustle, R. Jardak-Jamoussi, R. Ebel, C. Burkhardt, A. Bassler, T. Manthey, P. Cobanov, T. Wetzel, G. Krczal. Centrum Grüne Gentechnik, DLR Rheinpfalz, Breitenweg 71, 67435 Neustadt/W.

Die Reisigkrankheit, verursacht von einer Gruppe von Nepoviren, dem Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV) und Raspberry ringspot virus (RpRSV), ist die bedeutendste Viruskrankheit im deutschen Weinbau. Aufgrund fehlender genetischer Ressourcen für die klassische Kreuzungszüchtung wurde in einer Kooperation mit den Rebenpflanzguterzeugern ein transgener Ansatz für die Etablierung von Virusresistenz in den wichtigsten Unterlagsreben gewählt. Hierzu wurden virale Sequenzen von GFLV, ArMV und RpRSV mit möglichst hoher Homologie innerhalb des Virusstammes ausgewählt und in verschiedene Genkonstrukte, kombiniert mit 'defective interfering' (DI)-Sequenzen eines Potyvirus, sowie als 'Inverted Repeats' in den Pflanzentransformationsvektor pPZP200 mit pbar (Phosphinothricin-Resistenz) als Selektionsmarker kloniert. Ziel war die Induktion des sequenzspezifischen RNA-Silencing gegenüber homologen Sequenzen infizierender Viren. Die Genkonstrukte wurden zur Überprüfung des Konzeptes in Tabak (N. benthamiana) transformiert. Challenge Inokulationen der T0 und T1 Linien mit den relevanten Viren zeigten resistente und anfällige Phänotypen. Molekulare Untersuchungen lieferten erste Hinweise auf siRNA in den transgenen Tabaklinien. Zur Transformation von Reben wurden Antheren der Unterlagssorten SO4, Binova, 5C, 125AA und 5BB präpariert und zur Induktion von embryogenem Gewebe auf MS oder NN69-Medium mit verschiedenen Kombinationen von Auxin und Cytokinin inkubiert. Von allen Sorten konnten embryogene Linien etabliert werden. Die Transformation erfolgte durch Co-Kultur mit dem Agrobacterium-Stamm LBA 4404. Nach Selektion auf Phosphinotricin-haltigen Medien konnten nach 9-12 Monaten erste transgene Linien etabliert werden. Der Nachweis der Transgenität erfolgte über PCR und Southern blot. Weitere molekulare Untersuchungen zum Nachweis von siRNA als Hinweis für RNA-Silencing sind im Gange. Für den Nachweis der Virusresistenz der transgenen Unterlagen werden derzeit geeignete Labor- und Gewächshaus-Methoden entwickelt.

C. Timmermann (1), N. Bolle (1), R. Werner (2) und H.-P. Mühlbach (1). (1) Biozentrum Klein Flottbek, Universität Hamburg, Ohnhorststrasse 18, 22609 Hamburg, (2) Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, klinische Experimentelle Forschung, Haus 50, Ratzeburger Allee 160, 23538 Lübeck

Viroide sind die kleinsten bekannten Pflanzenpathogene. Das Potato spindle tuber viroid (PSTVd) ist ein typisches Mitglied der Familie Pospiviroidae. Es besteht aus einem 359 Nukleotide langen zirkulären, einzelsträngigen RNA-Molekül. Da Viroid-RNAs nicht für Proteine kodieren, sind sie bei allen biologischen Funktionen auf die Interaktion mit zellulären Faktoren der Wirtspflanze angewiesen. Um die Mechanismen der Viroid-Pathogenität besser verstehen zu können, haben wir unsere Untersuchungen auf die Analyse Viroid-RNA-bindender Proteine verschiedener Wirtspflanzen konzentriert. Durch das Screening einer cDNA-Expressionsbibliothek PSTVd-infizierter Tomatenpflanzen mit einer Digoxigenin-markierten PSTVd-Sonde konnten wir einen Transkriptionsfaktor der Tomate identifizieren, welcher an PSTVd bindet. In unseren Untersuchungen haben wir die strukturelle Organisation dieses Proteins in Tomatenpflanzen sowie in verschiedenen Wirts- und Nicht-Wirtspflanzen des PSTVd genauer analysiert. Mit Hilfe dieser Experimente soll die Funktion der Struktur des Transkriptonsfaktors sowie dessen Beziehung zum PSTVd und seine allgemeine Bedeutung für die Viroid-Pathogenese näher aufgeklärt werden.

S. Winter (1) und D.-E. Lesemann (2), (1) DSMZ AG Pflanzenviren, c/o BBA, Messeweg 11-12, 38104 Braunschweig, (2) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenviologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11-12, D-38104 Braunschweig

Eine vor einigen Jahren neu aufgetretene Viruserkrankung in Calibrachoa wurde zunächst als ein Isolat des Saguaro cactus virus (SCV) angesprochen, da in immunelektronen­mikro­skopischen Untersuchungen serologische Verwandtschaftsbeziehungen festgestellt wurden. Die eindeutige taxonomische Einordnung dieses Virus auf der Basis von serologischen und molekulargenetischen Untersuchungen ist jetzt abgeschlossen, so dass Calibrachoa mottle virus (CaMoV) als eigenständige Art der Gattung Carmovirus angesprochen werden kann. Verwandtschaftsbeziehungen zu SCV wurden nicht bestätigt. Antiseren gegen CaMoV und SCV zeigten in reziproken Untersuchungen weder im DAS-ELISA noch im Western-blot Kreuzreaktionen. Für beide Viren wurden in der SDS-PAGE deutliche Molekulargewichtsunterschiede der Hüllproteine, ca. 40 kDa für CaMoV und ca. 37 kDa für SCV, festgestellt. Die Rekonstitution des viralen Genoms erbrachte eine Genomgröße von 3901 Nukleotiden und eine für Carmoviren typische Genomorganisation. Das ssRNA-Genom besteht aus 5'- und 3'-untranslatierten Regionen und fünf offenen Leserastern (ORF) für RNA-abhängige RNA-Polymerase am 5'-Ende und Hüllproteingen am 3'-Terminus des Genoms sowie weiteren kleineren ORF mit möglicher „Movement“-Funktion. Enge Verwandtschafts­beziehungen zu anderen Carmoviren bestehen nicht.

P. Winterhagen (1), A. Bassler (1), U. Ipach (2), G. Krczal (1) und G. Reustle (1), (1) Centrum Grüne Gentechnik, Breitenweg 71, 67435 Neustadt/W., (2) DLR Rheinpfalz, Breitenweg 71, 67435 Neustadt/W.

Grapevine fanleaf virus (GFLV) wird von der Nematodenart Xiphinema index auf Reben übertragen und verursacht erheblichen wirtschaftlichen Schaden, da Reben keine natürliche Resistenz gegen die Infektion mit GFLV zeigen. Biotechnologische Methoden, wie Transformation mit Agrobakterien, erlauben die Übertragung virusabgeleiteter Sequenzen auf Reben, die Virusresistenz bewirken können. In Kooperation mit dem Bundesverband der Rebenpflanzguterzeuger und Rebveredelungsbetrieben wurden die wichtigsten Rebunterlagen mit verschiedenen Genkonstrukten transformiert. Methoden zur Überprüfung von Virusresistenz in Reben stehen zurzeit nicht zur Verfügung und sollen im Rahmen dieser Forschungsarbeit entwickelt werden. Für dieses Testsystem werden verschiedene Methoden zur Virusinokulation an in vitro Reben entwickelt und bewertet, um eine zuverlässige Infektion zu gewährleisten. Zum einen werden in vitro Reben an Blättern bzw. Wurzeln mechanisch mit verschiedenen Hilfsmitteln und unterschiedlichen Viruskonzentrationen inokuliert. Eine zweite Variante bedient sich dem natürlichen Infektionsweg über Nematoden. Als Dualkultur erfolgt der Besatz von in vitro Reben mit virustragenden Xiphinema index. Zur Inkubation werden verschieden lange Zeiträume und unterschiedliche Kulturbedingungen angesetzt und evaluiert. Sobald die Nematoden an den Rebwurzeln parasitieren, ist die Übertragung von Viruspartikeln in das Pflanzengewebe gegeben und eine Virusinfektion zu erwarten. Um eine erfolgreiche Virusinfektion nachzuweisen, werden molekularbiologische Methoden wie RT-PCR und IC-RT-PCR eingesetzt.

U. Harr und J. Schiemann, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Messeweg 11-12, 38104 Braunschweig

Modifizierte Volllängenklone phytopathogener Viren bieten die Möglichkeit einer effizienten und flexiblen Synthese von rekombinanten Proteinen in Pflanzen. Die Verwendung vermehrungsfähiger chimärer Viren wirft allerdings zahlreiche Sicherheitsfragen auf, so dass die Etablierung von Sicherheitssystemen zur Produktion von Fremdproteinen in Pflanzen mittels viraler Volllängenklone dringend geboten ist. Durch Kombination transgener Pflanzen mit einem modifizierten Virus wurde ein virales Expressionssystem erarbeitet, das einen sicheren Einsatz viraler Volllängenklone zur Synthese rekombinanter Proteine in Pflanzen gewährleistet. Grundlage des Sicherheitssystems ist ein Volllängenklon des Potato virus X mit deletiertem Transportproteingen (PVX 25k), der sich in Wildtyp-Pflanzen nicht systemisch verbreiten kann. Erst durch Kombination des modifizierten Volllängenklons mit transgenen Nicotiana benthamiana-Pflanzen, in denen das fehlende Transportprotein zur Verfügung gestellt wird, kann die Transportdefizienz komplementiert und eine systemische PVX-Infektion erreicht werden. Umfangreiche Versuche zur Sicherheit dieses Systems haben gezeigt, dass a) eine systemische Infektion von Wildtyp-Pflanzen weder mit dem Volllängenklon noch mit den daraus hervorgehenden Viruspartikeln möglich ist und b) auch nach einem der maximalen Nutzungsdauer entsprechenden Zeitraum von 12 Wochen keine Virusrekombinanten mit wiederhergestellter Transportfunktion in PVX 25k-infizierten transgenen Pflanzen nachgewiesen werden konnten. Die Wahrscheinlichkeit einer unerwünschten Verbreitung des transportdefizienten Virus ausserhalb des transgenen Systems wird daher als sehr gering eingestuft. Die Kombination Transportprotein-transgene Pflanze / transportdefizientes Virus bildet somit eine ideale Basis für eine sichere Synthese wirtschaftlich relevanter Proteine mittels viraler Volllängenklone.

L. Kopertekh, J. Schiemann, Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Institute for Plant Virology, Microbiology and Biosafety, Messeweg 11/12, D-38104, Braunschweig, Germany

Virus-based vectors are gaining an increasing importance as expression systems for the production of foreign proteins and recombinant antibodies, for the delivery of therapeutics, and as a powerful laboratory tool. We utilised a PVX plant virus vector to express Cre recombinase from bacteriophage P1 in plants. The Cre-lox site-specific recombination system consists of two components: lox sites and Cre recombinase. Cre recombinase can catalyze recombination between lox sites and cause inversions, deletions and integration events depending on the orientation and position of the recombination sites. This system has been applied to direct several types of plant genome modifications, including the following: regulation of gene expression, integration of foreign DNA, creation of single copy transformants, marker gene elimination, etc. Our study is aimed at transient expression of the Cre recombinase by a PVX vector to eliminate marker gene from lox-transgenic plants. Transgenic N. benthamiana plants containing the gfp reporter gene flanked with lox sites in the same orientation were designed. Progeny plants confirmed as transgenic by molecular analysis were inoculated with a PVX-Cre virus vector expressing Cre recombinase. Western blot analysis of PVX-Cre inoculated plants showed that Cre protein was expressed in infected leaf tissue. PVX CP protein accumulation correlated with Cre protein accumulation. Despite the large size of the insertion (1100 bp), the PVX-Cre recombinant virus was found to spread systemically through the plant. Higher level of Cre protein accumulation was detected in systemic leaves compared with inoculated ones. To obtain molecular evidence for the Cre-mediated excision event, PCR analysis was performed for PVX-Cre infected plants. Primers were designed to amplify a 2300-bp fragment from an unrecombined T-DNA. After the DNA recombination event, primers would amplify the rejoined sequence of 230 bp. DNA rearrangement consistent with site-specific excision of the gfp gene occurred in the PVX-Cre inoculated plants. PVX-Cre infected plants were allowed to self-pollinate to give T₁ generation. T₁ seeds were germinated and plants were tested by PCR to investigate the inheritance of Cre-mediated recombination. The progeny of one line produced PCR products indicating that gfp excision had been inherited. In summary, this study showed that (i) the inserted cre sequence was maintained in the PVX virus vector, (ii) enzymatically active Cre recombinase protein can be expressed to high levels by the PVX-Cre virus vector, and (iii) Cre-mediated recombination can be inherited in some plants. We propose that this transient expression system could be applied in various ways for genetic studies or in practical breeding. We have used this system as an alternative method for generating marker-free transgenic plants.